BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ
HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
α-GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN
DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ RỄ CỦ
THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex
Roxb.)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Hà Nội 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ
TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE
CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT n-HEXAN TỪ
RỄ CỦ THỔ PHỤC LINH (Smilax glabra Wall. ex
Roxb.)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Đào Thị Thanh Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1. TỔNG QUAN 3

1.1.

Tổng quan về Thổ phục linh 3

1.1.1.

Vị trí, phân loại chi smilax 3

1.1.2.

Đặc điểm thực vật và phân bố của thổ phục linh (Smilax glabra) 3

1.1.3.

Thành phần hóa học 4

1.1.4.

Công dụng của vị thuốc 9

1.1.5.


Nghiên cứu về thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-
hexan từ rễ củ Thổ phục linh 17

2.2.2.

Thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase (thử in vitro) 17

2.3.

Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1.

Phương pháp chiết 17

2.3.2.

Các phương pháp sắc ký 17

2.3.3.

Các phương pháp phân tích cấu trúc bằng phổ 18

2.3.4.

Phương pháp thử hoạt tính ức chế α-glucosidase 18

2.3.5.

Phương pháp xử lí số liệu 18

Kết luận 31

2.

Đề xuất 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 35

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ĐTĐ Đái tháo đường
NMR Nuclear magnetic resonance
H-NMR Hidro Nuclear magnetic resonance
C-NMR Carbon Nuclear magnetic resonance
Rha Rhamnosyl
Glc Glucosyl
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
PEESG Phenolic-Enriched Extracts of Smilax glabra
IL-6 Interleukin-6
TNF-α Tumor necrosis factor alpha
SG Smilax glabra
MIC Minimum inhibitory concentration
p-NPG
p- nitrophenyl-



Hình 3.1 Phổ
1
HNMR của hợp chất
(1)
Trang22
Hình 3.2 Phổ
13
CNMR của hợp chất
(1)
Trang 23
Hình 3.3 Phổ DEPT của hợp chất
(1)
Trang 24
Hình 3.4 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chếα-glucosidase của cao
chiết và chất sạch ở nồng độ 100 µg/mL
Trang27
Hình 3.5 Đồ thịtỷ lệ phần trăm ức chế enzym α-glucosidase khi
dùng đơn độc và dùng kết hợp acarbose và acid
betulinic

Trang28
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một nhóm các rối loạn chuyển hoá, đặc trưng
bởi đường huyết tăng cao, liên quan đến sự bất thường về carbohydrate, lipid
và protein. Bệnh gây ra các biến chứng mạn tính trên nhiều cơ quan như: biến
chứng mạch máu nhỏ, biến chứng mạch máu lớn, rối loạn thần kinh, biến
chứng trên thận, trên mắt Đây cũng là một trong những nguyên nhân hàng

2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzymα-glucosidase của các chất phân lập
được.

3

Chương 1.TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan vềThổ phục linh
1.1.1. Vị trí, phân loại chi smilax
Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan 1987[2], vị trí phân loại của
chi Smilax là:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Hành: Liliopsida
Phân lớp Hành: Liliidae
Bộ Khúc khắc: Smilacales
Họ Khúc khắc: Smilacaceae
Chi: Smilax
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của thổ phục linh (Smilax glabra)
Tên khoa học:Smilax glabra Roxb. (Smilax hookeri Kunth), họ Khúc khắc
(Smilacaceae)[5].
Tên khác: củ khúc khắc, củ kim cang [5].
Thổ phục linh ( Rhizoma Smilacis) là thân rễ phơi hay sấy khô của cây
thuộc chi Smilax, trong đó có Smilax glabra[5].
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật:
Thổ phục linh hay cây khúc khắc (Smilax glabra) là một loại cây sống lâu
năm, dài 4-5m, có nhiều cành nhỏ, gầy, không gai, thường có tua cuốn dài. Lá
hình trái xoan thuôn, phía dưới tròn, dài 5-13 cm, rộng 3-7cm, chắc cứng, hơi
mỏng, có 3 gân nhỏ từ gốc và nhiều gân con. Hoa mọc thành tán chừng 20-30
hoa. Cuống chung chỉ ngắn chừng 2mm, cuống riêng dài hơn, chừng 10mm
hay hơn. Quả mọng, hình cầu, đường kính 6-7mm, hơi 3 cạnh, có 3 hạt[5].

O
OR
5
R
6
O
HO
OR
1
OR
4
O5

Bảng 1.1. Các hợp chất acylsucroses

Tên chất
Nhóm thế
R1 R2 R3 R4 R5 R6
3’,6’-Bis-O-(4-
hydroxy-3-
methoxy-
Ecinnamoyl),
2,4,6-tri-Ac
OH
O
OH H O

3’,6’-Bis-O-(4-
hydroxy-3-
methoxy-
Ecinnamoyl), 1’-
O-(4-hydroxyE-
cinnamoyl),
OH 2,4,6-tri-Ac
OH
O
O

OH
O
O
H

H

O

1’,3’,6’-TrisO-(4-
hydroxy-
3-methoxycinna
moyl) (E,E,E-),
OH 2,4,6-tri-Ac
OH
O
O

OH
O
O
O
O
H


Luteolin Myricetin
7

OR
2
O
OH O
R
1
R
3
OH

Khung flavanon
Bảng 1.2. Các hợp chất flavanon
Tên chất Vị trí nhóm thế Cấu hình

R1 R2 R3
Taxifolin OH H OH 2R, 3R
Naringenin H H H 2S
Dihydrokaempferol OH H H 2R,3R
Sakuranetin H CH
3
H 2S
Isoastilbin ORha H OH 2R, 3S
Astilbin ORha H OH 2R, 3R
Neoastilbi ORha H OH 2S, 3S
Neoisoastilbin ORha H OH 2S, 3R
Engeletin ORha H H 2R, 3R

20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

StigmasterolR

-sitosterol H

-sitosterol-glucosid Gluc
1.1.3.4 Các hợp chất phenolic [16]
O
HO
O
OH
OH
OH
O
OH
HOOC
O
OH

Acid 5-O-caffeoylshikimic Acid

hoặc sấy khô, hoặc có thể rửa sạch, ủ mềm 3 ngày rồi thái mỏng, phơi hay sấy
khô[3].
1.1.4.1 Công dụng và liều dùng
Dùng để tẩy độc cơ thể, bổ dạ dày, khoẻ gân cốt, làm cho ra mồ hôi, chữa
đau khớp xương. Liều dùng: 10-20 gam 1 ngày dưới dạng thuốc sắc (có thể
dùng liều cao hơn) [5].
Thường dùng chữa: Tiêu hóa không bình thường, đau bụng tiêu chảy;
viêm thận, viêm bàng quang; phong thấp, viêm khớp, đòn ngã tổn thương;
tràng nhạc, mụn nhọt độc, lở ngứa, viêm mủ da, giang mai; giải độc thủy
ngân, bạc. Liều dùng: 15-30g, dạng nước sắc, cao nước hay hoàn tán. Không
dùng nước trà để uống thuốc [3].
Ở Lào: Rễ củ dùng để ngâm rượu cùng với các dược liệu thực vật và động
vật làm thuốc tăng lực. Quả dùng làm gia vị [3].
Ở Ấn Độ: nước sắc rễ tươi dùng trị đau bệnh hoa liễu và các vết loét[3].
Nguyên liệu chế nước ngọt giải khát tại Mỹ và những nước chịu ảnh
hưởng của văn hóa, phong tục Mỹ[5].
1.1.4.2 Tác dụng sinh học của vị thuốc
Thổ phục linh là vị thuốc dược sử dụng trong cả đông y và tây y, trong tây
y thổ phục linh được dùng làm thuốc tẩy máu, ra mồ hôi, chữa bệnh giang
mai [2]. Đã có nhiều nghiên cứu về cây thổ phục linh ở trên thế giới được
công bố, cho thấy các tác dụng của thổ phục linh:
10

Dịch chiết ethanol 90
0
từ thân rễ Thổ phục linh có tác dụng hạ đường
huyết trên chuột nhắt trắng [6].
 Tiêm dưới da: liều 100, 200mg/kg cân nặng, mức hạ đường huyết
mạnh nhất vào giờ thứ 2 và kéo dài trên 6h.
 Đường uống: mức hạ đường huyết mạnh nhất ở giờ thứ 8 và duy trì

faecalis),và một loài nấm (C. albicans).Kết quả cho thấy 3 phân đoạn trên đều
hoạt tính trên S. aureus, phân đoạnethyl acetatcó tác dụng trên C. albicans và
S.aureus với giá trị MIC là 200µg/mL. Trong 30 hợp chất được thử hoạt tính,
có 17 chất có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+), 10 chất có tác dụng trên nấm
và 8 chất có tác dụng trên Gram (-)[16].
1.1.4.3. Một số bài thuốc dân gian chứa thổ phục linh
Viện quân y 108 dùng để chữa bệnh vẩy nến[5]:
 Thành phần: Hạ khô thảo nam (80-120g), Thổ phục linh ( 40-80g)
 Cách dùng: sắc với nước (500ml) trong 3h ở nồi hấp 150
0
C, được
300ml chia 3 hoặc 4 lần uống trong ngày (Đã điều trị 21 người khỏi hẳn,
nhưng có trường hợp ghép philatop, 3 trường hợp đỡ 70-80%, 1 trường hợp
điều trị dở dang. Thời gian điều trị trung bình là 79 ngày, ngắn nhất 23 ngày,
dài nhất 118 ngày).
Chữa viêm mủ da: Thổ phục linh (30g), Kim ngân (15g), Cam thảo (15g).
Sắc uống [3].
Chữa phong thấp, gân xương đau nhức, tê buốt:Thổ phục linh (20g), thiên
niên kiện (8g), đương quy (8g), Bạch chỉ (6g), Cốt toái bổ (10g). Sắc uống
[3].
Chữa giang mai:Thổ phục linh (40g), Hà thủ ô (16g), vỏ Núc nác (16g),
gai bồ kết đốt tồn tính (8g), ké đầu ngựa (12g). Sắc uống [3].
Chữa phong thấp khớp: Hà thủ ô đỏ (8g), Sâm bố chính (8g), Thổ phục
linh (8g), Đỗ trọng (6g), Cỏ xước (6g), Tang kí sinh (8g), Vòi voi (8g), Cây lá
lốt (6g), Mắc cỡ gai (6g), Dây đau xương (6g). Sắc uống hoặc tán bột[3].
12

1.1.5. Một số sản phẩm chứa Thổ phục linh trên thị trường
 Miễn kim khang: dùng để chữa bệnh vẩy nến


các tá dược khác.
 Công dụng: Hỗ trợ điều trị bệnh gout, giảm acid
uric máu; hòa tan, giảm muối arat ở các khớp. Giảm
cơn đau, sưng tấy khớp ở bàn chân và ngón tay.
Ngăn ngừa sự tái phát các cơn đau, phòng ngừa tái
phát cơn gout cấp và biến chứng của bệnh gout.

13

1.2. Tổng quan về enzymα –glucosidase
Enzym α-glucosidase là enzym có ở biểu mô diềm bàn chải ở ruột non, là
enzym phân giải các dissaccharide và polysaccharide thành monosaccharide
[1,17], còn có những tên gọi khác như maltase,
glucoinvertase,
glucosidoinvertase,glucosidosucrase,maltase-glucoamylase
,
nitrophenyl
α
-
D
-
glucosidase,transglucosidase,
α
-glucopyranosidase,
α-D-glucosidase,
glucosidoinvertase,
α
-glucosidasehydrolase,
α
-1,4-glucosidase. Khi thức ăn

B, piperumbellactam C, acid 3,5-
dicaffeoylquinic,acid 4,5-
dicaffeoylquinic,castanospermin
3 Saponin
3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic acid, acid 28-O-α-
l-arabinopyranosyl-(1→4)-α-l-arabinopyranosyl-
(1→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-l-
rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester, …
4 Curcuminoid
Curcumim, demethoxycurcumin,
bisdemethoxycurcumin
5 Miscellaneous
Bromophenols, 2,4,6-tribromophenol (24) and 2,4-
dibromophenol
6 Phenolics
Chebulanin (19), acid chebulagic (20), acid
chebulinic, (-)-3-O-galloylepicatechin (22), (-)-3-O-
galloylcatechin (23)
15

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Thổ phục linh tươi được thu hái vào tháng 10/2013 tại Bắc Giang và
được giám định bởi PGS.TS. Trần Huy Thái, viện Sinh thái và tài nguyên
sinh vật, xác định được tên khoa học là Smilax glabra Wall. exRoxb Mẫu
được lưu tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá sinh biển.

2.1.2. Hóa chất, thuốc thử
- Dung môi chiết: ethanol 90%.

- Dụng cụ, thiết bị tinh chế
 Máy siêu âm(HWASHIN, Hàn Quốc)
 Máy hứng mẫu tự động (EYEL4, DC-1200)
 Máy cất quay chân không(Stuart, RE-3000DB, Mỹ)
 Bình cầu cất quay, bình tam giác, bình triển khai sắc ký, cốc thuỷ
tinh, ống đong chia vạch
 Pipet pasteur, pipet định mức 1 mL, 2 mL, 5 mL
 Máy sấy
 Bản mỏng tráng sẵn silicagel DC-Alufolien 60 F254, bản sắc ký pha
đảo RP18 (Merck, Germany RP C-18 F254)
 Cột sắc ký
 Silicagel pha thường (silica gel 240-430 mesh, Merck, Đức),
silicagel pha đảo (ODS-60-14/63, Fujisilisa, Nhật Bản.)…
- Thiết bị xác định cấu trúc: Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Bruker
AM500 FT-NMR Spectrometer)-Viện Hoá học, Viện hàn lâm khoa học
Việt Nam.
- Dụng cụ, thiết bị thử hoạt tính
 Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories, Mỹ)
 Bể ổn nhiệt, thiết lập ở 37
o
C
17

 Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc)
 Micropipet loại 10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL (Isolab, Đức)
 Đầu côn 20 µL, 200 µL, 1000 µL.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về thành phần hoá học có trong phân đoạn dịch chiết n-
hexan từ rễ củ Thổ phục linh
2.2.2. Thử hoạt tính ức chếenzym α- glucosidase của các chất phân lập được

Trích đoạn Phương pháp xử lí số liệu

---