i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
––––––––––––––––––
MAI HƢƠNG
NGHI£N CøU HO¹T TÝNH SINH HäC Vµ THµNH PHÇN
HãA HäC TRONG RÔ C¢Y THæ PHôC LINH
(
SMILAX GLABRA
ROXB.) CñA VIÖT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Tác giả luận văn
Mai Hƣơng

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH VẼ ix
MỞ ĐẦU 1
MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 3
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 4
1.1. Thực vật học và tác dụng chữa bệnh của Thổ phục linh (Smilax
glabra Roxb.) 4
1.1.1. Thực vật 4
1.1.2. Tác dụng chữa bệnh 6
1.2. Astilbin và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh 8
1.2.1. Astilbin 8
1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh 9
1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh 13
1.4. Tình hình nghiên cứu cây Thổ phục linh trên thế giới và trong
nước 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17
CHƢƠNG 2: CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

30
3.1.1.1. Qui trình phân lập astilbin và các hợp chất gần astilbin
theo SKLM 30
3.1.1.2. Số liệu phổ của các chất phân lập được 32
3.1.2. Khảo sát một số vùng nguyên liệu Thổ phục linh ở miền Bắc 33
3.1.2.1. Thu mua Thổ phục linh tại các vùng khảo sát 33
3.1.2.2. Quy trình chung phân lập và xác định hàm lượng
astilbin từ rễ Thổ phục linh khô 35
3.1.3. Giám định thu mua mẫu và xử lý mẫu Thổ phục linh 37
3.1.3.1. Giám định mẫu thực vật 37
3.1.3.2. Thu mua và xử lý mẫu 37
3.1.4. Tạo các cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40 38
3.2. Xác định hàm lượng astilbin trong các cao chiết TPL-EtOH,
TPL-As40 39
3.2.1. Thiết lập thông số cho sắc ký lỏng 39
3.2.2. Thiết lập chương trình chạy 40
3.2.3. Thiết lập các điều kiện thí nghiệm cho hệ thống sắc ký lỏng 40
3.2.4. Thiết lập trình tự chạy cho các mẫu 41
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của hợp chất cần phân tích trong các mẫu 42
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

3.3. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của
các cao chiết 45
3.3.1. Thử nghiệm hoạt tính độc tế bào các cao chiết TPL-EtOH, TPL-
As40 45
3.3.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa 47
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
4.1. Astilbin và một số hoạt chất tách được từ rễ Thổ phục linh 49
4.2. Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ TPL tại miền Bắc…….……….58

Viết đầy đủ
Ac
Nhóm axetyl
ACN
Axetonnitrin
n-Bu
Nhóm n-butyl
BALB/c
Chuột bạch tạng
13
C-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 (Cacbon-13 Nuclear
Magnetic Resonance)
CC
Sắc ký cột (Column chromatography)
DCM
Diclometan
DMF
N,N-Dimethylformamit
DMSO
Dimethylsulfoxid ((CH
3
)
2
SO)
DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
ED
50
Nồng độ bảo vệ tối thiểu 50%

50
Nồng độ ức chế 50% (Imhibitory Concentration 50%)
IR
Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
KB
Tế bào ung thư biểu mô (Human Epidemoid Carcinoma)
LU-1
Tế bào ung thư phổi (Human Lung Carcinoma)
MCF-7
Dòng tế bào ung thư vú người (MCF-7 Human breast
adenocarcinoma cell line)
MTT
3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoli bromua
MCPBA
m-Chloroperbenzoic acid
MDA
Malonyl dialdehyd
MS
Phổ khối lượng (Mass spectrometry)
Me
Nhóm metyl
n-hx
n-hexan
NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân(Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy)
OD
Mật độ quang (Optical Density)
PTLC
Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer

t
Triplet
dm
Doublet of multiplets
q
Quartet
ppm
Parts per million
m
Multiplet
Hình 1.8: Các cấu từ phenolic mới được tách từ RSG 18
Hình 3.1: Sơ đồ tách astilbin và các hợp chất gần trên SKLM 31
Hình 3.2: Hình ảnh các mẫu Thổ phục linh ở các vùng 35
Hình 3.3: Sơ đồ phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh khô 36
Hình 3.4: Mẫu Thổ phục linh thân lá và củ tươi 37
x
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 3.5: Hình ảnh mẫu Thổ phục linh tươi tại Tuyên Quang 38
Hình 3.6: Sơ đồ tạo cao chiết TPL-EtOH, TPL-As40, TPL-Đường 39
Hình 3.7: Sơ đồ trình tự chạy các mẫu 42
Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh AE trên cột Zorbax Eclipse 43
XDB C
18
(4,6 x 150nm, 5µm) 43
Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- đường trên cột Zorbax Eclipse
XDB C
18
(4,6 x 150nm, 5µm) 43
Hình 3.10: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- AS4O trên cột Zorbax Eclipse
XDB C
18
(4,6 x 150nm, 5µm) 44
Hình 3.11: Sắc ký đồ của mẫu Thổ phục linh- EtOH trên cột Zorbax Eclipse
XDB C
18
(4,6 x 150nm, 5µm) 44
Hình 4.1: Chất 1 (Astilbin) 50
Hình 4.2: Phổ
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có một hệ thực
vật vô cùng phong phú, đa dạng và là một nguồn tài nguyên thiên nhiên vô
cùng quý giá. Thực vật được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, trong đó
hàng nghìn loại thực vật đã được sử dụng làm thuốc.
Do sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam từ thực vật
ngày càng có giá trị to lớn trong việc chữa bệnh. Ngày nay bên cạnh các loại
thuốc tổng hợp hóa học thì việc sử dụng các loại cây cỏ, thảo mộc để điều chế
thuốc cũng được phát triển rộng rãi và ngày càng được ưa chuộng. Nhiều loại
thuốc được sản xuất từ dược liệu Việt Nam như Berberin, Palmatin… Ngoài
ra các hợp chất thiên nhiên được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu
… Từ đó đặt ra yêu cầu về việc hiểu rõ thành phần, cấu trúc hóa học cũng như
hoạt tính sinh học của các cây thuốc càng được đề cao.
Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học
của các loài cây thuốc tại Việt Nam, nhằm mục đích sử dụng chúng một cách
hợp lí, khoa học và hiệu quả đang ngày càng có tầm quan trọng hơn. Các cây
thuốc quí trong các bài thuốc dân gian đã và đang được quan tâm nghiên cứu
đầy đủ về hoạt chất và hoạt tính sinh học, trong khuôn khổ các đề tài cấp Viện
Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, cây Thổ phục linh đã được lựa
chọn nghiên cứu.
Thổ phục linh (Smilax glabra) vốn là một loại cây mọc hoang ở các vùng
miền núi ở nước ta. Từ rất lâu đời, trong Y học cổ truyền Việt Nam, thổ phục
linh được sử dụng trong nhiều bài thuốc chữa các bệnh về gân cốt, trị giun
sán, ung nhọt, giải độc, chống viêm …Theo Y học cổ truyền Trung Quốc thì
rễ của thổ phục linh có tác dụng giải độc, làm giảm mất nước, có thể được sử
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỤC ĐÍCH VÀ Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Mục đích của đề tài
Mục đích của đề tài là nghiên cứu cơ sở khoa học tạo tiền đề cho các nghiên
cứu tạo chế phẩm giá trị cao từ rễ Thổ phục linh với các mục tiêu đề ra là:
- Phân lập hoạt chất chính astilbin và một số hoạt chất khác trong rễ cây
Thổ phục linh.
- Tạo các cao chiết với hàm lượng astilbin cao.
- Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất astilbin các mẫu cao
chiết.
- Thử hoạt tính sinh học về độc tế bào và hoạt tính chống oxy hóa của
các cao chiết.
- Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Các kết quả của đề tài là cơ sở
cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc điều chế chế phẩm chống oxy hóa có
giá trị cao từ rễ Thổ phục linh, nguồn nguyên liệu quí và phong phú ở nước ta.
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/


Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Trong đó Smilax glabra (Roxb.) phân bố
chủ yếu ở Trung Quốc, Ðài Loan, Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam.[1]
Thổ phục linh là loại cây leo, sống lâu năm, trườn dài 4-5m (có thể tới
10m), phân nhiều cành. Cành nhỏ, mềm, không gai, lá mọc so le, hình bầu dục
hoặc trái xoan, dài 5-11cm, rộng 1-5cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên sang
bong, mặt dưới bệch như có phấn trắng, khi khô lá có màu hat dẻ rất đặc sắc,
gân chính 3, cuống lá dài 1cm mang tua cuốn mảnh và dài do lá kèm biến đổi.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá, cuống rất ngắn hoặc gần như không cuống, mang 1
tán đơn gồm nhiều hoa màu vàng nhạt, cuống hoa mảnh như sợi chỉ, dài 1cm
hoặc hơn. Hoa đực và hoa cái riêng rẽ, hoa đực có lá đài hình tim dày, cánh hoa
bầu hơi khum, nhị không cuống, bao phấn thuôn, hoa cái giống hoa đực. Sinh
trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, ra hoa đầu tháng năm. Tuy nhiên chỉ những
cây được chiếu sáng đầy đủ mới có nhiều hoa, quả. Quả mọng, hình cầu, đường
kính 6-7mm gần như 3 cánh, chứa 3 hạt, khi chin màu đen.
Mùa hoa : Tháng 5-6, mùa quả : tháng 8-12, thu hoạch vào mùa hạ và mùa
thu. Tái sinh tự nhiên tốt từ hạt hoặc các phần rễ củ còn lại sau khi bị chặt phá.
Ở Việt Nam, Thổ phục linh phân bố rải rác khắp các tỉnh ở miền núi
cũng như trung du và 1 vài đảo lớn. Một số tỉnh được coi là có nhiều Thổ
phục linh phân bố tập trung như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái
Nguyên, Hòa Bình, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An,
6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vùng tây Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, và các tỉnh Tây Nguyên.
Thổ phục linh là cây ưa sáng, chịu hạn tốt và có thể sống được trên nhiều loại
đất, thường mọc lẫn với nhiều loại cây khác trong các quần hệ thứ sinh trên
đất sau nương rẫy, đồi cây bụi, rừng đang phục hồi do khai thác kiệt. Thổ
phục linh cũng hay gặp dưới tán rừng thông thưa hay chưa khép tán. Độ cao
phân bố dưới 1000m, hoặc 1500m (ở Thái Lan). Cây ưa khí hậu nóng và ẩm
của vùng nhiệt đới, đồng thời cũng có thể chịu lạnh tốt ở nhiệt độ tối thấp

tác dụng của các loại thuốc khác. Trên thế giới, nhiều loài Thổ phục linh
thuộc họ Smilax với tên Sarsaparilla đã được sử dụng trong thương mại ở
dạng rễ củ thái mỏng sấy khô hoặc dạng cao dịch chiết etanol dùng làm đồ
uống trong sinh hoạt hàng ngày.
Thân rễ Thổ phục linh có hoạt tính trị giun, sán lá gan nhỏ, và kháng siêu vi
khuẩn, lợi tiểu, chống viêm. Thử nghiệm trên chuột , tác dụng chống viêm rõ rệt
đối với giai đoạn viêm cấp tính cũng như mạn tính thực nghiệm trong mô hình
phù bàn chân gây bằng kaolin và mô hình hạt thực nghiệm gây bằng amian,
đồng thời có tác dụng gây thu teo tuyến ức chuột cống, ức chế miễn dịch, nâng
cao được tỷ lệ chuột lang sống qua cơn choáng phản vệ, làm giảm nhẹ cơn dị
ứng trong thí nghiệm tiêm mẫn cảm chuột lang bằng kháng nguyên và sau đó
gây dị ứng nhẹ bằng cách đưa kháng nguyên vào đường hô hấp trong buồng khí.
Thổ phục linh có những tính chất của một thuốc chống viêm steroid. [1]
Ngoài ra, Thổ phục linh còn có tác dụng kháng histamine. Nước sắc của
một bài thuốc gồm Thổ phục linh và 15 dược liệu khác được chứng minh có
hoạt tính đối kháng với các tác dụng gây khó thở và co giật trên chuột lang hít
khí dung histamine, và với tác dụng gây hạ áp trên động vật tiêm histamine.
Trong thử nghiệm in vitro, Thổ phục linh làm giảm co thắt cơ trơn ruột chuột
lang cô lập gây bởi histamine và acetylecholin. Trong thử nghiệm in vitro,
thuốc có tác dụng ổn định màng hồng cầu của aspirin. Cao chiệt với methanol
ức chế mạnh hoạt tính của protein kinase C trên thực nghiệm. Flavonocid của
Thổ phục linh có tác dụng ức chế enzym oxy hóa khử peroxydase và catalase
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

máu chuột và huyết thanh người. Thử nghiệm độc tính cấp và bán trường
diễm cho thấy Thổ phục linh hầu như không độc. [1]
Cao chiết với methanol từ thân rễ Thổ phục linh với liều 100 mg/kg thể
trọng, tiêm phúc mạc, đã làm hạ glucose máu của chuột nhắt trắng bình
thường 4 giờ sau khi tiêm, và cũng làm giảm glucose máu chuột nhắt gây đái

1.2: Công thức cấu tạo của astilbin
Tên IUPAC: (2R,3R)-2-(3‟,4‟-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3- [(2S,3R,4R,
5R, 6S) -3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-1-yl] oxy-2,3- dihydrochromen-4-ol.
Tên thường gọi là: Astilbin; Taxifolin-3-O-α-L-rhamnopyranoside.
Dạng đồng phân này của astilbin được phân lập từ rễ của cây thổ phục
linh Smilax glabra Roxb. Astilbin được xem là hoạt chất chính trong rễ Thổ
phục linh. Astilbin được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc, nó có tác
dụng trừ sâu, kháng khuẩn và làm lành vết thương. Những nghiên cứu mới
đây đã chỉ ra astilbin có tác dụng chống ung thư [20], tác dụng bảo vệ gan
[26], chống oxy hóa [19] và kháng khuẩn [21].
1.2.2. Thành phần hóa học trong rễ Thổ phục linh
Trong dịch chiết nước của rễ Thổ phục linh, polysaccharide chiếm hàm
lượng rất lớn đến 32% trọng lượng mẫu khô, điều này giải thích vì sao rễ Thổ
phục linh đã từng được sử dụng thay lương thực khi nạn đói xuất hiện ở
Trung Quốc. Rất nhiều các cấu tử có hoạt tính sinh học trong rễ Thổ phục
linh, chúng quyết định dược học của rễ Thổ phục linh, đã được phân lập.
Trong đó, lớp chất các flavonoid được xem là các cấu tử hoạt tính chính,
ngoài ra là các hợp chất phenylpropanoid glycoside, lignan glycoside, các
polyphenol, phenolic acid và các glycoside của nó bao gồm là các resveratrol,
các axit hữu cơ và một số các hợp chất khác. Tổng cộng có đến khoảng 40
hợp chất đã được phân lập từ rễ Thổ phục linh.
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Các flavonoid [29-30]: Lớp hoạt chất chính trong rễ thổ phục linh là các
flavonoid, trong đó 12 flavonoid đã được tách ra thuộc về 5 loại hợp chất là
dihydroflavonol, dihydroflavone, flavonol, isoflavone và flavanol. Trong các
flavonoid được phân lập thì dihydroflavonol có hàm lượng chính bao gồm
khoảng 10 cấu tử là astilbin (3-O-α-L-rhamnoside-5,7,3',4'-
tetrahydroxydihydroflavonol)(1) hay (taxifolin-3-O-α-L-rhamnoside) và các

từ RSG
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Các axit hữu cơ bao gồm các butan diacid, palmitic acid, và 2,2-
dimethylsuccinic acid.
Các chất sterol gồm các β-sterol và stigmasterol. Cuối cùng là các hợp
chất khác như các fructoside, các hợp chất dị tố, các axit amine, protein, ….
1.3. Hoạt tính sinh học của rễ cây Thổ phục linh
Những nghiên cứu dược lý về Thổ phục linh đã bộc lộ dịch chiết methanol
hay dịch chiết nước của nó có nhiều hoạt tính như: chống ung thư; hạ đường
huyết; bảo vệ gan; điều hòa miễn dịch; chống viêm nhiễm, thấp khớp; kháng
vi khuẩn và diệt côn trùng; chống men HIV-1 và tổ hợp HIV-1.
Hoạt tính chống ung thư: Năm 2005, Thabrew và cộng sự [23] cũng
đã nghiên cứu dịch cô của Thổ phục linh ảnh hưởng độc tế bào trên tế bào gan
HepG2 với giá trị ED
50
là 41µg/ml và giá trị ức chế 50% của sự tổng hợp
ADN là 29µg/ml. Năm 2008 [20], Sa và cộng sự đã công bố nghiên cứu về
dịch chiết của Thổ phục linh trong đó astilbin và smilagenin đã được xác định
như là cấu tử chính trong dịch chiết này bởi HPLC có hoạt tính chống lại sự
tái tạo tế bào ung thư gan dòng HepG2 và Hep3B.
Hoạt tính hạ đường huyết: Atsushi Kato và cộng sự, năm 1997, đã thí
nghiêm trên chuột KK-Ay, một trong những mẫu động vật bị đái tháo đường
không phụ thuộc insulin, với dịch chiết methanol của Thổ phục linh. Kết quả
cho thấy dịch chiết metanol của Thổ phục linh với liều 100 mg/kg thể trọng
làm giảm lượng đường trong máu ở chuột bình thường 4 giờ sau khi tiêm và
cũng làm giảm đường trong máu của chuột KK-Ay dưới điều kiện tương tự
(P<0.001) [13]. Cũng trong năm 1997, các kết quả nghiên cứu của Haraguchi
và cộng sự chỉ ra các dihydroflavonol (taxifolin) và glycoside của nó

cứu cho thấy astilbin có cơ chế tác dụng ức chế miễn dịch khác so với
cyclosposin A và nó có tính chọn lọc cao [12] [28].
Hoạt tính chống viêm nhiễm, thấp khớp: Một trong những mô hình
được sử dụng rộng rãi nhất để nghiên cứu tính chất chống viêm nhiễm và
viêm khớp của các hợp chất là chất hỗ trợ điều trị viêm khớp (AA) áp dụng
trên chuột. Khi tiêm chất bổ trợ vào 1 chân của chuột không chỉ chân tiêm bị
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

viêm (Viêm sơ cấp) mà chân còn lại cũng bị viêm (Viêm thứ cấp). Sử dụng
mô hình này Jiang và cộng sự (năm 1997) [15-16] đã đưa ra kết quả dịch chiết
nước của thổ phục linh ức chế đáng kể phù nề trên chân viêm thứ cấp của
chuột. Nó tác dụng một cách trực tiếp và theo cơ chế kháng CIR một cách
chọn lọc khác biệt so với hoạt tính không chọn lọc của các steroid trong điều
trị viêm thấp khớp. Các nghiên cứu xa hơn khả năng kháng viêm của astilbin được
so với cyclosporin A cho thấy astilbin tác dụng yếu hơn nhưng chọn lọc và không
có bất cứ biểu hiện độc tế bào nào. Cơ chế của nó bao gồm một sự áp đảo chọn
lọc lên chức năng lympho bào thông qua sự giảm sinh MMP và NO [6].
Hoạt tính kháng khuẩn và trừ sâu: Năm 2005, những thực nghiệm
của Cintra và cộng sự đã cho thấy astilbin ức chế đáng kể sự phát triển côn
trùng [23]. Năm 2006, Moulari và cộng sự, đã phát hiện astilbin có hoạt tính
kháng khuẩn mạnh với cả vi khuẩn gram âm (Acinetobacter sp., Moraxella
sp) và vi khuẩn gram dương (M. Luteus, S epidermidis) [17].
Hoạt tính kháng protease HIV-1 và tổ hợp HIV-1: Năm 2006,
Tewtrakul đã công bố kết quả điều tra về hoạt tính kháng protease HIV-1 của
dịch chiết ethanol và dịch chiết nước của Thổ phục linh cho thấy dịch chiết
ethanol thể hiện hoạt tính kháng HIV-1 IN (là hoạt tính chống tổ hợp HIV-1)
với giá trị IC
50
là 6,7µg/ml và của dịch chiết nước là 8,5µg/ml [22].