Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ NINH

N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
NC
C
Ứ
Ứ
U
UH
H

Ọ
Ọ
C
CV
V
À
ÀT
T
H
H
À
À
N
N
H
HP
P
H
H
Ầ
Ầ

Â
Â
Y
YC
C
Ổ
ỔY
Y
Ế
Ế
M
ML
L
Á
ÁB
B
Ó
Ó

L
L
A
A
X
X
U
U
M
M(WALL.) COGN.]C
C
Ủ
Ủ
A
AV
V
I
I
Ệ
Ệ
T

luận văn là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử
dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một
công trình nào khác.

Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
LỜI CẢM ƠN

Luận án này được thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa
học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam
Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn GS.TSKH. Trần
Văn Sung, người thầy đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm việc.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa học Phòng Tổng hợp Hữu
cơ – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin được cảm ơn các cán bộ phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng

1.3.2. Môi trƣờng sống 5
1.3.3. Tính vị và tác dụng 5
2. Hoạt tính sinh học của cây cổ yếm lá bóng 7
3. Thành phần hóa học 8
3.1. Các carotenoid 8
3.2. Các polysaccharid 9
3.3. Các sterol 9
3.4. Các flavonoid 10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.5. Các saponin 11
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19
2.1.1.Mẫu thực vật 19
2.1.2. Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập chất 20
2.1.3. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học 20
2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20
2.2.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa 20
2.2.2. Thử hoạt tính chống ung thƣ 21
2.2.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 22
3.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 22
3.1.1. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22
3.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ
BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật 27
3.2.2. Chiết tách các chất từ dịch chiết etyl acetat 28
3.2.3. Chiết tách các chất từ dịch chiết n-BuOH 30
3.3. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
br : Broad (NMR)
d : Doublet (NMR)
δ : Độ chuyển dịch hoá học (NMR)
DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer
DMSO : Dimethyl sulfoxide
D
2
O : Nƣớc đã đƣợc đơteri hoá
EI : Electronic impact
EtOAc : Ethyl acetate
FT : Fourier transform
HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation
HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence
COSY : Correlation Spectroscopy
IR : Infrared
J : Hằng số tƣơng tác (NMR)
m : Multiplet (NMR)
Me : Methyl
MeOH : Methanol
MS : Mass spectrometry
NMR : Nuclear magnetic resonance
ppm : Parts per million
Rf : Retention factor
s : Singlet (NMR)
t : Triplet (NMR)

33
4.2
Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào
34
4.3
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
36
4.4
Số liệu phổ
1
H và
13
C-NMRcủa chất 43; 44; 45 và 46
38
4.5
Các chất phân lập từ cây Cổ yếm lá bóng
72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu
hình
Tên hình
Trang
1.1
Ảnh một số loài thuộc chi Gynostemma
6
2.1
Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn. thu hái ở Hoà Bình

C-NMR của chất 43
45
4.6
Phổ
1
H-NMR của chất 44
47
4.7
Phổ
1
H-NMR của chất 44 (giãn rộng)
48
4.8
Phổ
13
C-NMR của chất 44
49
4.9
Phổ
13
C-NMR của chất 44 (giãn rộng)
50
4.10
Phổ DEPT và
13
C-NMR của chất 44
51
4.11
Phổ MS của chất 44
52

59
4.18
Phổ DEPT và
13
C-NMR của chất 45
60
4.19
Phổ
1
H-NMR của chất 46
62
4.20
Phổ
1
H-NMR của chất 46 (giãn rộng)
63
4.21
Phổ
13
C-NMR của chất 46
64
4.22
Phổ
13
C-NMR của chất 46
65
4.23
Phổ DEPT và
13
C-NMR của chất 46

Ƣu điểm của các loại thảo dƣợc là có tác dụng tốt vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là Âu
dƣợc, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ.
Trong số 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae) có mặt
tại Việt Nam, Giảo cổ lam là dƣợc liệu quý đuợc nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh
Kỳ phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997. Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên
loài dƣợc liệu này đã đƣợc tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dƣợc
lý và từ đó, đƣa vào khai thác và sử dụng nguồn dƣợc liệu quý hiếm này phục vụ
chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. Trong số 2 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall.)
Cogn. (hay còn gọi là cây Cổ yếm lá bóng) là dƣợc liệu đƣợc ngƣời dân ở Trung
Quốc sử dụng tƣơng tự nhƣ Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn
tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau
nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh. Tuy nhiên, cho tới nay,
ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hoá học,
tác dụng dƣợc lý cũng nhƣ độc tính của loài này.
2 Nhằm mục tiêu góp phần tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng Cổ yếm lá bóng
làm thuốc do đó đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học từ
cây Cổ yếm lá bóng
[
[
G
G
y
y
n
n
o
o

c
c
ủ
ủ
a
aV
V
i
i
ệ
ệ
t
tN
N
a
a
m
m

” đƣợc
thực hiện với các nội dung chính sau:
- Tạo dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau.
- Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết.
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất từ dịch chiết.

13
- (2D
NMR): COSY, NOESY và các phƣơng pháp khá
.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
-
Gynostemma sẽ đóng góp vào kho tàng các hợp chất thiên nhiên
của Việt Nam và thế giới.
-
hiệu quả và bền vững.
6. Bố cục luận văn
Luận văn gồm có 78 trang trong đó có 5 bảng và 28 hình, 38 tài liệu tham khảo
Nội dung luận văn đƣợc chia nhƣ sau:
Phần mở đầu (3 trang)
Chƣơng 1 – Tổng quan (14 trang)
Chƣơng 2 – Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (3 trang)
Chƣơng 3 – Thực nghiệm (12 trang)
Chƣơng 4 – Kết quả và thảo luận (43 trang)
Tài liệu tham khảo (3 trang)

4
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1. Họ Cucurbitaceae và chi Gynostemma [1, 2, 3, 10]
Theo các tài liệu về Thực vật và phân loại thực vật, Gynostemma laxum (Wall.)
Cogn. thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), vị trí của G.laxum (Wall.) Cogn. trong hệ thống
phân loại thực vật đƣợc tóm tắt nhƣ sau:

nách lá. Cây đực và cây cái riêng biệt. Lá kép hình chân vịt. Cổ yếm lá bóng (giảo cổ
lam ba lá) mọc tự nhiên ở độ cao 300 – 3200 m tại các cánh rừng hoặc thung lũng
hoặc trên các sƣờn núi, những nơi ẩm thấp nhƣ bên bờ suối, trong các bụi cây, phân
bố rộng rãi ở các quốc gia nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal,
Bangladesh, SriLanka, Lào, Myanmar và Việt Nam. Giảo cổ lam lần đầu tiên đƣợc
phát hiện vào năm 1976 tại Nhật Bản. Tuy nhiên, giảo cổ lam đã đƣợc các bộ lạc sống
trên núi cao sử dụng từ hơn 500 năm trƣớc đó với mục đích kéo dài tuổi thọ. Tuổi thọ
bình quân của họ đạt đƣợc rất cao đến gần trăm tuổi. Ở Việt Nam Phạm Thanh Kỳ
nguyên hiệu trƣởng trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, chủ nhiệm Bộ môn Dƣợc liệu lần
đầu tiên phát hiện thấy cây này trên núi Phanxipang (Lào Cai) vào những năm 1997,
sau đó đƣợc Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học chính xác. Hiện nay, Giảo cổ lam
cũng đã đƣợc tìm thấy trên những vùng núi cao ở các tỉnh phía Bắc nhƣ Cao Bằng,
Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình.
1.3.3 Tính vị và tác dụng

- Tính vị : Vị đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, ngừng ho, long
đờm, kiện tráng, cƣờng tinh, chống lão suy, chống mệt mỏi, kháng ung thƣ.
- Công dụng: Ở Vân Nam (Trung Quốc), cây đƣợc dùng điều trị viêm khí quản
mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và
đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh. Ngoài ra còn tăng
sức đề kháng cho cơ thể, chống viêm và nhiễm trùng. Tác dụng làm hạ mỡ máu, nhất
là giảm cholesterol toàn phần, ngăn ngừa các bệnh nhƣ xơ vữa mạch máu, chống
huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não. Chống lão
hoá, giảm căng thẳng mệt mỏi, giúp tăng lực, tăng khả năng làm việc. Tăng cƣờng hệ
miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành và phát triển của các khối u. Giúp dễ ngủ và ngủ
sâu giấc, tăng cƣờng máu lên não, ngăn ngừa chứng mất trí nhớ ở ngƣời già. Rất tốt
cho tế bào gan, tăng cƣờng chức năng giải độc của gan. Điều chỉnh rối loạn chuyển
6
nhồi máu cơ tim gây ra co thắt động mạch vành và ức chế sự tăng nồng độ acid béo tự
do sau nhồi máu cơ tim. Gypenosid ở nồng độ 50, 100 và 200 mg/mL thể hiện hoạt
tính bảo vệ đối với tế bào cơ tim bằng cách ức chế tổn thƣơng gây bởi glucose và sự
thiếu hụt oxygen cũng nhƣ ức chế sự giải phóng creatin phosphokinase và lactat
dehydrogenase. Tiêm tĩnh mạch gypenosid (5 và 10 mg/kg) vào chó cũng làm tăng
lƣu lƣợng máu qua động mạch vành. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy
gypenosid ức chế sự tổng hợp nitrit của đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS.
Nghiên cứu sâu hơn cho thấy gypenosid ức chế hoạt tính và sự sao chép gen iNOS
bằng cách giảm hoạt tính của NF-kB. Sự ức chế sinh tổng hợp NO bằng cách ức chế
sự thể hiện gen của iNOS hoặc hoạt tính của nó là một mục tiêu quan trọng trong việc
điều khiển một số bệnh lý nhƣ viêm và xơ cứng động mạch. Những kết quả này cho
thấy tầm quan trọng của các gypenosid trong việc điều khiển sinh tổng hợp NO
[28].3. Thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam [6-16, 28-38].
Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin
rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe
về phòng ngừa và chữa bệnh. Khi so sánh hàm lƣợng saponin giữa một số loài cùng
chi, loài G. pentaphyllum đƣợc biết đến với hàm lƣợng saponin cao nhất trong chi
này, kế đến là G. pubescens và thấp nhất là G. longipes
[15]
.Thành phần hóa học chủ
yếu của giảo cổ lam là saponin và flavonoid. Các saponin trong cây giảo cổ lam (còn
gọi là gypenosid hay gynosaponin) có cấu trúc triterpen khung dammaran, trong đó có
nhiều hợp chất đã đƣợc xác định có trong thành phần saponin trong nhân sâm và tam
thất. Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các carotenoid, polysaccharid, sterol, các acid
amin tan trong nƣớc, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lƣợng nhƣ Zn, Fe, Se.
8


dimetylcholestanol cũng đƣợc Akihisa tìm thấy vào năm 1986 trong các loại cây
thuộc họ Cucurbitaceae. Chondrillasterol (2) và spinasterol (3), hai đồng phân lập thể
tại C-24, là hai sterol chính có trong cây này [15]. Ngoài ra, các acetylen sterol đầu
tiên (4, 5, 6, 7) cũng đƣợc phân lập từ cây giảo cổ lam vào năm 1989 [19].
H
H
HO
H
H
2:Chondrillasterol
H
H
HO
H
H
3:Spinasterol
H
HO
H
H
H
H
HO
H
H
4
5
6
7
H

gặp nhất là nhóm hydroxyl, thƣờng thấy xuất hiện ở C-3, C-20, C-21 và C-25, ít gặp
hơn là ở C-2, C-12, C-19 và C-24. Các nhóm chức khác nhƣ nối đôi ở C-23, C-24 và
C-25, aldehid ở C-19 và keton ở C-12 cũng thấy xuất hiện trong một vài hợp chất.
Các đơn vị đƣờng có trong các saponin này chủ yếu là β-D-glucopyranose, β -D-
11 xylopyranose, a-L-arabinopyranose và a-L-rhamnopyranose, thƣờng thấy ở vị trí C-3
(có cấu hình β), ở C-20 và C-21.
R
5
O
R
3
H
H
R
7
R
6
R
1
R
2
R
4
1
9
18
17

Trong đó R
1
-R
7
có thể :
R
1

R
2

R
3

R
4

R
5

R
6
R
7
H
H
CH
3

H

12 rhamnopyranose
R
5
O
R
3
R
1
R
2
R
4
1
9
18
17
28
29
30
R
5
OH
O
20
O
HO
O


R
5

R
6

H
H
CH
3

H
j
H
Glycosid OH
k l


O
R
1
HO
HO
O
O
OH
HO
HO
OH
OH
12
O
R
2
HO
23
24
26
27
3
14 R
1
=H R
2
= H
15 R
1
= CH

27
24
O
12
18
3
OH

Năm 2004, tác giả Norberg A. và các cộng sự, trong đó có các nhà khoa học
Việt Nam đã phân lập đƣợc 1 gypenosid mới, đặt tên là phanosid (19). Phanosid với
liều 500 μM kích thích tạo ra insulin (in vitro) ở mức gấp 10 lần khi lƣợng glucose là
33 mM và có khả năng kích tạo insulin ở mức gấp 4 lần khi mức glucose là 16.7 mM.
Ở mức đƣờng huyết trên 2 μM hoạt chất glibenclamid, một thuốc tân dƣợc đƣợc sử
14 dụng trong điều trị tiểu đƣờng, chỉ có khả năng kích thích tạo insulin gấp hai lần. Khi
cho chuột uống phanosid 40 và 80 mg/ml, khả năng hấp thụ glucose đƣợc cải thiện
đáng kể và mức insulin huyết thanh cũng đƣợc tăng cƣờng [22].
O
O
HO
HO
O
OH
O
OH
HO
O
OH