Bô Y tế
Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ
Nghiên cứu thành phần hóa học
và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật
(Eriochloa ramosa (Retz.) Hack. họ Poaceae
Chủ nhiện đề tài TS.Lê Thị Kim Loan
Cơ quan chủ trì đề tài Viện Dợc liệu
7440
10/7/2009
Trong đó kinh phí SNKH 270 triệu đồng
năm 2008 Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ 1. Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ
mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Thị Kim Loan
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
4. Cơ quan quản lý đề tài: BộY tế
5. Danh sách những người thực hiện chính:
- TS. Lê Thị Kim Loan - Viện Dược liệu
- PGS.TS. Bùi Thị Bằng - Việ
CM
Dịch chiết nước cỏ mật
Mn
Dịch chiết cồn ( ethanol ) cỏ mật
MC
Dịch chiết cồn- nước cỏ mật
MCN
Polyssccharid/cỏ mật
MN
1
Lớp chất còn lại sau loại polysaccharid trong dịch chiết
nước cỏ mật
MN
2
Sắc ký lớp mỏng
SKLM
Methanol
MeOH
Phổ khối lượng phun mù điện tử
ESI-mS
Độ quay cực
NAPQI
Thể tích trung bình hồng cầu
MCV môc lôc
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2
2.1 Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá
tổn thương gan
2
2.1.1 Bệnh viêm gan
2
2.1.2 Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan
4
2.2 Thuốc và phương pháp điều trị viêm gan
5
2.2.1 Thuốc điều trị viêm gan
5
2.2.2 Các phương pháp điều trị viêm gan
8
2.3 Tổng quan về cây cỏ mật
( Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.)
3.3.3.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
17
3.3.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn
18
3.3.3.7 Nghiên cứu độc tính cấp
19
3.3.3.8 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
19
3.3.3.9 Phương pháp xử lý kết quả
20
4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
21
4.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật
21
4.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học
24
4.2.1 Định tính các thành phân hóa học
24
4.2.2 Định lượng các thành phần hoa học trong cao nước và cao cồn cỏ
mật
26
4.2.3 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa
học trong cỏ mật
27
4.2.3.1 Nghiên cứu phân lập một số thành phần hóa học
4
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
80
4.3.2.4 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên mô bệnh học gan chuột
81
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
4.3.2.5 Ảnh hưởng của cỏ mật lên nồng độ MDA trong dịch đồng thể
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl
4
-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR
90
4.3.3 Nghiên
cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan của cao nước cỏ
mật
91
4.3.4 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cao cỏ mật khi phối
hợp với phối hợp với phenobarbital103
4.3.5 Nghiên cứu tác dụng lợi mật của cao nước cỏ mật
103
4.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của cỏ mật 104
ĐT.
- Danh sách tác giả
- Những bài báo đã công bố
147
BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới
của đề tài KH&CN cấp Bộ
1. Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ
mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae
2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Thị Kim Loan
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu
4. Thời gian thực hiện (BĐ-KT): Tháng 7/2006 đến tháng 7/2008 ( Đã được gia hạn
đến tháng 2/2009)
5. T
ổng kinh phí thực hiện Đề tài: 270 triệu đồng
Trong đó, kinh phí từ NSNN: 270 triệu đồng
6. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:
6.1/ Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc : Hoàn thành các nội dung nghiên
cứu
6.2/ Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: Đạt các yêu
cầu khoa học và các chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm.
6.3/ Về tiến độ thực hiện : So v
ới thời gian thực hiện xác nhận trong ĐC bị chậm vì
vậy CNĐT và Cơ quan chủ trì ĐT đã có công văn gửi Vụ KH và ĐTxin gia han.
CNĐT và Viện DL đã nhận được QĐ của Vụ KH và ĐT, cho phép ĐT được kết thúc
vào tháng 2/2009
7. Về những đóng góp mới của đề tài:
Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm
Hà Nội.,ngày 20 tháng 12 năm2008
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Họ, tên và chữ ký) 1
thuốc có tác dụng tốt lại có sẵn trong tự nhiên là công việc hết sức cần thiết và có ý
nghĩa thực tiễn. Cây cỏ mật là cây mọc hoang
ở vùng đồng bằng và trung du nước ta.
Theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số địa phương như Nam Định, Phú thọ, Sơn
tây dùng cỏ mật để chữa cảm sốt, chữa mụn nhọt và chữa các bệnh về gan mật. Một
số tác giả trong nước cũng đã nghiên cứu về tác dụng hạ sốt, giảm đau, lợi mật, lợi
tiểu của cỏ mật trên thự
c nghiệm [11], [26] nhưng chưa thấy có nghiên cứu nào về
tác dụng bảo vệ gan và phục hồi tổn thương gan của cây này. Để có cơ sở khoa học
trong việc sử dụng cây thuốc này với mục đích làm thuốc bảo vệ và phục hồi tổn
thương gan, chúng tôi tiến hành thực hiện Đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và
tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., họ
Poaceae với
các mục tiêu sau:
- Xác định thành phần hóa học chính của cây cỏ mật.
- Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập các nhóm hoạt chất chính trong cây cỏ
mật
2
- Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của hoạt chất toàn phần.
- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình súc vật thí nghiệm của hoạt chất toàn
phần
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
2.1. Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương
gan
2.1.1. Bệnh viêm gan
Viêm gan là bệnh lý thường gặp trong các bệnh về gan mật. Bệnh viêm gan
thường được chia làm hai loại dựa vào sự tiến triển củ
a bệnh, đó là:
- Viêm gan cấp: Khi có bất thường về gan dưới 6 tháng hoặc về mặt giải phẫu
liều cao sẽ sinh ra nhiều N-acetyl-p-benzoquinoneimin (NAPQI ), đó là chất gây tổn
3
thương tế bào gan [7],[45]. Theo thống kê tại Trung tâm chống độc thuộc Bệnh viện
Bạch mai, ngộ độc thuốc hạ sốt giảm đau trong 2 năm 1998-2000 chiếm 6,34% số
các trường hợp ngộ độc. Đến năm 2002-2003, tỷ lệ này tăng lên 12,2% và đứng thứ
ba trong các loại ngộ độc thuốc. Viêm gan cấp do một số thuốc khác, đặc biệt là do
dùng thuốc chống lao Isoniasid phối hợp với Rifampicin cũng thường g
ặp, trong số
đó có một số trường hợp đã gây tử vong.
- Viêm gan cấp do nhiễm độc
Các trường hợp thường gặp là nhiễm độc thuốc trừ sâu, phẩm nhuộm, nấm độc,
nhiễm độc thực phẩm hoặc các hóa chất dùng trong công nghiệp như Carbon
tetraclorid (CCl
4
). CCl
4
là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình. Trong quá
trình chuyến hóa, CCl
4
tạo thành các gốc tự do, chính các gốc tự do này sẽ liên kết
với lipid và các protein trên hệ thống lưới nội mô của tế bào gan gây phá hủy cấu
trúc và chức năng của hệ thống lưới, làm tổn thương gan [41], [47]. Mức độ tổn
thương phụ thuộc vào liều lượng CCl
4
, dạng tổn thương thường tập trung chủ yếu ở
vùng trung tâm tiểu thùy. Chính vì vậy CCl
4
hay được dùng trong mô hình gây viêm
gan cấp để nghiên cứu thuốc có tác dụng bảo vệ gan.
Như vậy tổn thương gan do rượu là do tăng quá trình peroxy hóa lipid và làm giảm
các chất chống oxy hóa [10], [35].
- Viêm gan mạn tính tự miễn: Là tình trạng mất khả năng thích ứng miễn dịch của
gan với chính các tổn thương gan. Nguyên nhân và cơ chế chưa rõ song viêm gan
mạn tính tự miễn luôn có mặt các tự kháng thể và tăng gama globulin máu [10].
- Viêm gan tiềm tàng: Là những trường hợp có biểu hiện tình trạng viêm gan mạn
tính nhưng không tìm được nguyên nhân. Hiện nay với các phương pháp nghiên cứu
hiện đại như y sinh học phân tử, miễn dịch học, thì viêm gan tiềm tàng đã giảm do
đã xác định được nguyên nhân và điều trị kịp thời [10].
2.1.2. Một số xét nghiệm thường dùng để đáng giá tổn thương gan
Gan là cơ quan quan trọng trong cơ thể, được thể hiện thông qua các chức năng
do gan đảm nhận. Các xét nghiệm của hệ thống gan, mật rất đa dạng và phong phú,
có vai trò lớn trong quá trình chẩn
đoán và tiên lượng bệnh. Khi tế bào gan bị tổn
thương, một số enzym có nhiều trong gan sẽ được giải phóng vào máu. Do vậy để
đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan sẽ dựa vào việc tiến hành các xét nghiệm xác
định hoạt độ các enzym có nguồn gốc ở gan trong máu và thăm dò hình thái mô
bệnh học của gan.[16],[22].
* Trên lâm sàng: Để thăm dò sự huỷ hoại tế bào gan thường xác định hoạt độ của
các enzym transaminase trong huyết thanh vì khi tế
bào gan bị tổn thương các
enzym này thường thay đổi sớm nhất và có tính chất đặc trưng. Trong số đó có hai
loại enzym được chú ý nhất , đó là :
1. AST ( Aspartat aminotransferase): Enzym này có ở hai nơi trong tế bào . Phần
lớn nó tồn tại trong ty thể và một phần nhỏ trong bào tương. Enzym này có ở nhiều
mô khác nhưng nhiều nhất ở cơ tim, gan và cơ xương [19],[22]
2.ALT (Alanin aminotransferase): Là enzym chỉ có trong bào tương, đặc trưng cho
các bệnh lý ở gan vì có mặt nhiều nhất ở
gan, rất ít ở cơ tim và cơ vân [19], [22].
Trong viêm gan do virut hoặc do nhiễm độc, hoạt độ AST và ALT trong huyết
Trong các loại thuốc này IFNα dược sử dụng khá rộng rãi trong điều trị viêm gan
virut B và C trong hơn một thập kỷ nay. Tuy nhiên tác dụng kháng virut của IFNα là
không đặc hiệu và hiệu quả cũng còn hạn chế. Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng
IFNα liều 3-5 triệu UI trong thời gian từ 16 đến 24 tu
ần (4-6 tháng) chỉ khoảng 30-
40% số người dùng có chuyển đảo huyết thanh và khoảng 10% mất HBV-DNA. Sau
khi ngừng thuốc một thời gian, khoảng 50% số bệnh nhân tái phát, xuất hiện HBV-
DNA trở lại. Mặt khác các IFNα tái tổ hợp hiện nay còn nhiều tác dụng không mong
muốn và đắt tiền, hơn nữa cần điều kiện bảo quản khá nghiêm ngặt ( nhiệt độ bảo
quản 2-8
0
C), nhất là khi vận chuyển xa gặp nhiều khó khăn. Gần đây nhiều tác giả
còn nhận thấy sử dụng IFNα ( nhất là dạng IFNα2a) , khi vào cơ thể có tính kháng
nguyên vì thế cơ thể sẽ sinh kháng thể và như vậy làm giảm tác dụng điều trị.[55]
- Các thuốc tương tự nucleosid : Các chất tương tự nucleosid điều trị viêm gan
mạn thường được sử dụng là Lamivudine (LAM). LAM cũng như các ch
ất tương tự
nucleosid khác gây ức chế quá trình tổng hợp ADN của virut . Sử dụng LAM cho
bệnh nhân với liều 100mg hàng ngày sau 12 tháng thấy tỷ lệ chuyển đảo huyết thanh
16-18% (so với nhóm dùng giả dược tỷ lệ này là 4-6%). Tỷ lệ này tăng lên khi dùng
LAM kéo dài 2,3,4 năm. Do thuốc ít độc tính nên có thể dùng kéo dài. Như vậy
dùng thuốc dài ngày gây tốn kém cho bệnh nhân nhưng quan trọng hơn là hiện nay
đã xuất hiện dòng đột biến kháng Lamivudin [43].
* Nhóm thuốc bảo vệ
tế bào gan
- Cơ chế tác dụng của thuốc bảo vệ gan
Các thuốc bảo vệ gan (Hepatoprotective drug) có tác dụng duy trì sự ổn định của
tế bào gan, làm cho tế bào gan vững bền trước sự tấn công của các tác nhân gây
bệnh. Đề bảo vệ tế bào gan, các loại thuốc này có thể tác dụng theo các cơ chế sau:
+ Tác dụng chống viêm mạn: Cả ba loại chế phẩm dịch chiết ethanol 40%, dịch
chiết nước và tinh dầu bồ bồ đều có tác dụng chống viêm mạn trên mô hình u hạt
th
ực nghiệm, trong đó dịch chiết nước và dịch chiết ethanol có tác dụng tương
đương còn tinh dầu có tác dụng yếu so với hai chế phẩm trên.
+ Độc tính
Độc tính cấp : Không xác định được LD
50
Độc tính bán mạn : Không ảnh hưởng đến các chức năng tạo máu, chức năng
gan, thận.
- Ứng dụng trong điều trị
7
Bồ bồ được dùng chữa cảm sốt, viêm gan, vàng da, viêm ruột, làm thuốc kích
thích ăn ngon cho phụ nữ sau khi sinh [3 ],[6]
Một chế phẩm được bào chế từ bồ bồ có bổ sung tinh dầu (đặt tên là Abivina)
cuả Viện Dược liệu đã thử lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan virus bệnh viện Nhi
trung ương, viện quân y 103 có tác dụng tốt vì vậy thuốc đã được Cục Dược, Bộ Y
tế cấp giấy phép sản xuất
Diệp hạ châu đắng (Herba phyllanthi amari)
-Thành phần hóa học: Lá diệp hạ châu đắng chứa các chất đắng hypophylanthin,
phylanthin. Ngoài ra còn có flavonoid (1,15%), alcaloid kiểu securinin như
niuroidin, isobubialin, epibubianin, quercetin, quercitrin, các acd hữu cơ,
tanin(7,78%) [3 ].
-Tác dụng sinh học [3 ]
+ Tác dụng bảo vệ gan
Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng được gây
nhiễm độc gan bằng carbon tetraclorid, làm giảm hàm lượng colagen trong máu, làm
Actiso được dùng làm thuốc thông tiểu, thông mật chữa các bệnh suy gan, thận,
viêm thận cấp và mạn.
Nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae)
-Thành phần hoá học: Trong thân rễ nghệ vàng có rất nhiều thành phần hoá học
như tinh dầu, chất béo, chất vô cơ và nhóm chất màu. Trong đó nhóm chất màu
được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh học. Nhóm chất màu curcuminoid gồm 3
chất là curcumin, demethoxycurcumin và bis demethoxycurcumin.
-Tác dụng sinh học: Curcuminoid có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan
cấp thông qua hai cơ chế [3],[20]
+ Ức chế isoenzym của CYP ( CYP2E
1
), ngăn chặn quá trình chuyển hoá PAR
thành chất độc N-acetyl- benzoquinoneimin (NAPQI) và CCl
4
thành CCl
3
+ Chống oxy hoá, ức chế quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan.
- Ứng dụng trong điều trị: Nghệ vàng được dùng trong Y học cổ truyền để chữa
các bệnh về gan, mật [3]. Curcuminod được dùng như một loại thực phẩm chức
năng để phòng chống ung thư như ung thư đường tiêu hoá, gan hoặc một số trường
hợp ung thư khác.
Ngoài ra còn rất nhiều các dược liệu khác đã được nghiên cứu tác dụng b
ảo vệ
gan như cà gai leo, nhàu, nhó đông, chàm tía, nhân trần, chè đắng [6].
2.2.2. Các phương pháp điều trị viêm gan
- Viêm gan mạn tính: Cho đến nay bệnh viêm gan mạn không có biện pháp điều trị
đặc hiệu.
+ Với viêm gan mạn tính giai đoạn ổn định thì chế độ ăn và sinh hoạt hợp lý là
- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc.
* Eriochloa villosa (Thunb.) Kuath. 1829- Paspalum villosum Thunb. 1784-
Panicum tuberculiflorum Steud. 1854- Cỏ mật lông, Cỏ mật nhiều lông
- Phân bố: Cao Bằng, còn có ở Ấn Độ, Trung quốc, Nhật Bản
- Dạng sống và sinh thái : Cỏ 1 năm, cao 30-100cm. Mọc ở ven bờ kênh, rạch,
ruộng nước.
- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc
*Eriochloa procera ( Retz.) C. Hubb.1930 ( CCVN,3 : 813) - Agorostis procera
Retz. 1786 - Milium ramosum Retz. 1791- Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.1906 , Cỏ
mật thân cao
- Phân bố: Bắc bộ, Trung bộ, Cần Thơ, còn có ở Trung Qu
ốc, Thái Lan và một số
nước nhiệt đới khác ở châu Á, châu Phi, châu Mỹ
- Dạng sống và sinh thái: Cỏ 1 năm, cao 30-150cm. Mọc ở ruộng hoang, bãi cỏ
ven đường.
- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc
2.3.2 Tổng quan về cỏ mật thân cao ( Eriochloa procera (Retz.) C.Hubb. (Syn.
E. ramosa (Retz.) Hack.)
10
Ảnh 2.1. Ảnh của loài Eriochloa
procera (Retz.) C.Hubb. (Syn. E.
ramosa (Retz.) Hack. ) * Đặc điểm thực vật [3]
Cây thảo, sống lâu năm. Rễ hình sợi, mọc dầy đặc. Thân khí sinh mọc thành bụi
- Kết quả nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Thị Thanh Xuân trong khoá luận tốt
nghiệp đại học cho biết cao cỏ mật ( chiế
t bằng ethanol 90% ) có tác dụng lợi mật,
lợi tiểu, giảm đau (theo phương pháp gây đau bằng mâm nóng) và hạ sốt trên chuột
nhắt trắng [26].
* Công dụng
Cỏ mật được dùng theo kinh nghiệm của nhân dân một số vùng như Sơn Tây,
Nam Định để chữa cảm sốt, cúm, sốt xuất huyết.[3],[11]
Cho đến nay (2008) chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào của các tác giả
nước ngoài về thành phần hoá học và tác dụng dụng sinh h
ọc của cây cỏ mật thân
cao
3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu để nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng
sinh học là cây cỏ mật thu hái tại Đông Anh- Hà Nội vµo thêi ®iÓm c©y b¾t ®Çu ra
hoa
- Nguyên liệu để nghiên cứu tác dụng sinh học là các lớp chất chiết xuất và phân
lập từ toµn c©y cỏ mật ( bá rÔ ), liều thí nghiệm được tính tương đương với d
ược
liệu
3.2. Hóa chất và động vật thí nghiệm
3.2.1 Thuốc và hóa chất phục vụ nghiên cứu tác dụng sinh học
- Carbon tetraclorid của hãng Placebo (CE), paracetamol (Trung Quốc),
carboxymethylcellulose (CMC) (Thuỵ Điển). Dầu olive (Thailand). Silymarin (biệt
dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70mg của hãng Madaus (Korea).
- Kít định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, bilirubin
toàn phần, cholesterol, albumin, creatinin của hãng DIALAB GmbH (Áo).
- Dung dịch xét nghiệm mẫu ABX Minidil LMG của hãng ABX – Diagnostics.
- Các hóa chất nghiên cứu dùng để xác định hàm lượng MDA trong gan: Acid
Thu thập các mẫu cây tại nhiều địa phương, mô t
ả hình thái, đối chiếu với các tài
liệu để xác định tên khoa học.
3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học trong dược liệu
* Nghiên cứu định tính các thành phần hóa học.
- Định tính các thành phần hóa học bằng các phản ứng hóa học [ 2 ]
- Định tính các thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [ 2 ], [6 ]
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel, DC-Alufolien
60 F
254
( Merck 1,05715), RP
18
F
254s
(Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở các
bước sóng 254nm, 366nm hoặc dùng thuốc thử tương ứng phun đều lên bản mỏng,
sấy khô đến khi hiện màu
* Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học
13
- Định lượng các chất tan trong ethyl acetat có trong cao nước và cao cồn : Dược
liệu (cân và xác định độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó cô đến
cao lỏng. Lắc cao lỏng với ethyl acetat nhiều lần, gạn lớp ethyl acetat, làm bay hơi
dung môi và làm khô cắn. Cân cắn để tính hàm lượng các chất tan trong ethyl acetat
trong cao nước và cao cồn cỏ mật.
-Định lượng nitơ amin có trong cao nước và cao cồn theo phương pháp ghi trong
DĐVN I, tập 1.[5]
Dược liệu (cân và xác đị
nh độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó
cô đến cao khô. Cân cao khô. Lấy 1g cao thêm 40ml nước, đun cánh thủy cho tan
chất thiên nhiên
+ Độ quay cực [α]
D
đo trên máy JASCO DIP-1000KUY polarimeter của Viện Hóa
học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam
14
+ Phổ khối ( ESI-MS) : Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Eletron spray ionization
mass spectra )đo trên máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp
chất thiên nhiên.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (MNR) :
1
H-NMR (500MHz),
13
C-NMRR (
125MHz) đo trên máy Brruke AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học
thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam.
3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học.
3.3.3.1.Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan
* Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetraclorid (CCl
4
) trên chuột
nhắt trắng:
Chuột nhắt trắng được chia thành nhiêu lô, mỗi lô 10 con:
+ Lô 1 (chứng sinh học- C
sh
): Uống nước cất + tiêm dầu olive
+ Lô 2 (chứng bệnh lý- C
bl
) : Uống nước cất + tiêm CCl
ngày
lấy máu và gan
tiêm CCl
4
Uống thuốc hoặc uống nước cất
1 2 3 4 5 6 7 8 9
15
- Định lượng hoạt độ AST, ALT theo phương pháp Reitman-Franker [30]
- Xác định nồng độ MDA
Nồng độ MDA được xác định theo phương pháp Mitsuru Uchiyama và Midori
Mihama. MDA là sản phẩm chuyển hóa trung gian của quá trình peroxy hóa lipid,
MDA phản ứng với acid thiobacbituric tạo phức trimethine màu hồng, có đỉnh hấp
thụ cực đại ở bước sóng 530-532nm.
Mức độ hấp thụ màu OD (X
E
) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA.
Hàm luợng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn
MDA trong cùng điều kiện.
Cách tiến hành: Giết chuột nhắt trắng, mổ lấy gan, bảo quản gan trong đá lạnh. Cân
400mg gan, nghiền trong 9,6ml dung dịch KCl lạnh (1 lít dung dịch chứa 1,2g KCl)
trên máy nghiền đồng thể.
Dung dịch phản ứng gồm 2ml dung dịch đồng thể gan chuộ
t + 0,4ml dung
dịch acid ascorbic 0,04352% + 0,4ml dung dịch muối Mohr 0,001645%.
Đặt các ống chứa dung dịch phản ứng trong bình điều nhiệt ở 37
0
paracetamol, lấy máu động mạch cảnh để định lượng enzym AST, ALT và bilirubin,
đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA và quan sát mô bệnh học.
16
3.3.3.2.Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan
Chuột nhắt trắng, được chia thành 7 lô, mỗi lô 10 con. Gây tổn thương gan chuột
bằng cách tiêm màng bụng CCl
4
3 ngày liên tục, với liều 0,2ml/kg/ngày (pha 0,2ml
CCl
4
trong 3,8ml dầu olive, tiêm 0,04ml/10g). Ngày thứ ba, sau khi tiêm CCl
4
1 giờ
bắt đầu cho uống nước cất, sylimarin (67mg/kg) hoặc cao cỏ mật (9,0g/kg) tương
ứng với từng lô theo sơ đồ 3.2. Chuột được lấy máu động mạch cảnh để định lượng
các enzym AST, ALT và bilirubin, lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA
và làm tiêu bản mô bệnh học ở các thời điểm sau uống thuốc 2 ngày và 4 ngày.
Sơ đồ 3.2 Thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu tác dụng tăng phục hồi tổn
thương gan
Ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7
Lô 1 tiêm dầu olive nước cất nước cất giết 5 chuột
Lô 2 tiêm CCl
4
nước cất giết 5 chuột
100mg/kg
- Đ
ánh giá kết quả dựa vào thời gian tiềm tàng và thời gian ngủ của chuột.
Copyright: Tài liệu đại học ©