BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BÙI THỊ KHÁNH LINH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)
Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY
TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT
TRẮNG BẰNG PARACETAMOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ
HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BÙI THỊ KHÁNH LINH
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)
Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY
TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT
TRẮNG BẰNG PARACETAMOL
qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn,
khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015.
Tác giả Khóa luận
Bùi Thị Khánh Linh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG
(Hovenia dulcis Thunb.) 2
1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia 2
1.1.3 Phân loại chi Hovenia 3
1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng
(Hovenia dulcis Thunb.) 3
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI
HOVENIA 4
1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis 4
1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia 7
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI
HOVENIA 7
1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis 7
1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa 11
3.3 BÀN LUẬN 41
3.3.1 Về thành phần hóa học 41
3.3.2 Về tác dụng bảo vệ gan 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADH Alcohol dehydrogenase
ALT Alanin amino transferase
AST Aspartat amino transferase
BuOH, Bu n - buthanol
dd dung dịch
EtOAc, Et Ethyl acetat
EtOH, C Ethanol
Hx n – hexan
HD Hovenia dulcis
HDT Hovenia dulcis Thunb.
KK Khúng khéng
KKC Cắn chiết Ethanol toàn phần của Khúng khéng
KKE Cắn chiết phân đoạn Ethyl acetat của Khúng khéng
MDA Malonyl dialdehyd
MeOH Methanol
MYR Myricetin
NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin
OD Optical density (Mật độ quang)
PAR Paracetamol
R
f
Retension factor
SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)
1 Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 5
2 Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 6
3 Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng 13
4 Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan 17
5 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn Khúng khéng 30
6 Hình 3.2: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn n-hexan (Hx) của Khúng khéng
31
7 Hình 3.3: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng
33
8 Hình 3.4: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân
đoạn n-buthanol (Bu) của Khúng khéng
34
9 Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử tác dụng bảo vệ gan của Khúng
khéng
37 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Khúng khéng - còn gọi là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo [7], [11] có tên khoa học
Hovenia dulcis Thunb., họ Táo ta (Rhamnaceae), là một loài cây được trồng và mọc
hoang rải rác tại các tỉnh phía Bắc, chủ yếu ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Trên thế giới
đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
Khúng khéng. Trong đó nổi bật là tác dụng bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc
như CCl
4
, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các mô hình gây độc
1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia
Cây rụng lá hoặc hiếm khi cây bụi, cao tới 25m. Cành non có nhiều lông
hoặc có lông măng. Lá thay liên tiếp, cuống lá dài, 3 gân, gân chính với gân bên 4-8
đôi, phiến lá không cân, mép răng cưa.
Hoa trắng hoặc màu vàng - xanh, lưỡng tính, mẫu 5, cụm hoa chuỳ mọc ở kẽ
lá hoặc cuối cành. Đài ống hình bán cầu, thuỳ hình tam giác, hướng trục có sống rõ
ràng. Cánh hoa hình elip hoặc hình trứng, hơi dính nhau ở đáy, hiếm khi có khía ở
đỉnh, thường bao bọc hoàn toàn nhị hoa, có mở rộng khi nở. Nhị hoa được bao bọc
bởi cánh hoa, chỉ nhị hình mũi mác, bao phấn đính lưng. Đĩa gần tròn, dày, nhiều
thịt, thường có nhiều lông tơ, hiếm khi nhẵn, làm đầy ống đài. Bầu nhuỵ ở thấp hơn
bên dưới 1 nửa, gần như hoàn toàn chìm trong đĩa, bầu 3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn,
kiểu 2 hoặc 3 miếng, chẻ nhánh sâu.
Quả hạch gần hình cầu, nhẵn hoặc nhiều lông, đế với ống đài không rụng,
đỉnh mới, vỏ quả giữa như da, thường tách từ màng vỏ quả trong; khi chín những
nhánh con mang quả trở nên nạc và nhiều nước. Hạt 3, màu hơi nâu hoặc hơi đen,
bóng, dẹt hoặc hình cầu, thường có vết lõm [20].
3
1.1.3 Phân loại chi Hovenia
Theo phân loại của Nguyên Tiến Bân và các cộng sự chi Hovenia chỉ có 01
loài là Hovenia dulcis Thunb. [1].
Tuy nhiên theo Thực vật chí Trung Quốc [20], chi Hovenia gồm có 3 loài như
sau:
- Hovenia dulcis Thunb.
- Hovenia acerba
- Hovenia trichocarpa
1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng (Hovenia
dulcis Thunb.)
1.1.4.1 Đặc điểm thực vật
Cây gỗ to hoặc hiếm khi cây bụi, cao từ 7 - 10m hoặc hơn [9], [10]. Vỏ thân,
dulcis, thấy có các thành phần sau:
- Quả chứa: lipid 74%, protein 3,07%, acid toàn phần 358,8 mg/kg, ascorbat
16,29 mg/100g, đường 28,55%, đường khử 13,96%, acid amin 2,38 mg/100g và các
nguyên tố vi lượng như Fe, Ca, Cu, Mn, P, Zn… [11].
- Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện của các nhóm chất:
flavonoid [26], [41], [45]; alcaloid [31], [33]; saponin [15], [42], [43], [44].
1.2.1.1 Flavonoid
Năm 2000, trong công bố về bằng sáng chế liên quan đến cây Khúng khéng
[26], tác giả Kim H.S và Lee H.Y đã phân lập được hợp chất Hovenodulinol (I) có
cấu trúc tương tự các flavonoid khác trong Khúng khéng đã được phân lập trước đó
như Hovenitin (II), (+) Ampelopsin (III), Laricetrin (IV), Myricetin (V), (+)
Gallocatechin (VI) [11]. (hình 1.1)
Năm 2013, Wu long-huo và cộng sự đã tách được 10 hợp chất từ cây Khúng
khéng bao gồm kaempferol (VII), myricitin (VIII), dihydromyricitin (IX), 5,7-
dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon (X), chrysophanol (XI), ethyl caffeat (XII), 3-
hydroxy-4-methoxybenzoic acid (XIII), β-sitosterol (XIV), epicatechin (XV) và
5
vanillin (XVI). Trong đó các hợp chất X, XI, XII, XIII và XV là lần đầu phân lập
được trên loài này [41]. (hình 1.1)
Hovenodulinol (I) Hovenitin (II) (+) Ampelopsin (III)
Myricetin (V) (+) Gallocatechin (VI)
Hodulorid I Hovenidulciocosid A1 R=R1; A2 R=H
Hình 1.2 : Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng
Các nghiên cứu về sau thấy 4 hợp chất loại damaran 16-17 seco là
hovenidulciocosid A1 A2 B1 B2 đã được chiết xuất và xác định cùng với hodulosid
III. Chúng đều có tác dụng ức chế sự giải phóng histamin [43].
7
Năm 2002, Atta ur Rahman đã công bố trong cây Khúng khéng có rất nhiều
saponin như jujuboside B, hoduloside I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, hovenoside
I, saponin C2, saponin E và saponin H. Đây là các saponin đặc trưng cho chi
Hovenia [15]. Bên cạnh các saponin này, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện thêm
các hodulosid V là những damaran glucosid [11].
1.2.1.3 Alcaloid
Ba alcaloid peptid bao gồm frangulanine, hovenin A, hovenin B được phân
lập từ dịch chiết methanol của vỏ rễ. Trong khi Hovenin A đã được xác định cấu
trúc là des-N-methyl-frangulanine (II) thì cấu trúc của Hovenin B chưa được làm
sáng tỏ [31].
Hạt Khúng khéng chứa alcaloid perlorin, perlolyrin, β – carbolin [7], [11],
[33].
1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia
Các công trình nghiên cứu đã phân lập được 25 hợp chất từ quả của Hovenia
acerba và xác định được cấu trúc của 23 hợp chất như: Hovenin A, B, C, D;
myricerin, quecertin, laricetin, kaempferol, hovenitin I, epigallocatechin… và 2
saponin triterpenoid mới như acerboside A và acerboside B [18].
Ngoài ra có 3 steroid được phân lập lần đầu tiên: beta-sitosterol, 3-beta-
hydroxy-3-deoxymoronic acid và beta-sitosteryl-3-O-beta-D-glucopyranoside [47].
Trong hạt của Hovenia trichocarpa, 2 saponin mới là dẫn xuất của
pseudojujubogenin đã được phát hiện và xác định cấu trúc [49].
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA
được nghiên cứu. Khi sử dụng ethanol (50%, v/v, 10 mL/kg) trong 6 tuần trên chuột
thí nghiệm cho thấy tổn thương gan với sự gia tăng đáng kể (P < 0,01) các enzym
gan như AST, ALT, γ-GT trong huyết thanh và mức độ peroxid hóa lipid của gan
(LPO). Ngược lại, khi sử dụng nước hoa quả hoặc giấm lên men từ Hovenia dulcis
(10 mL/kg) cùng với ethanol cho thấy sự giảm đáng kể (P < 0,05) các enzym (AST,
ALT và γ-GT), các chỉ số gan, nồng độ triglyceride và cholesterol trong huyết
thanh, LPO gan. Những con chuột được sử dụng nước trái cây hoặc giấm lên men
9
từ Hovenia dulcis cho thấy hệ thống chống oxy hóa tốt hơn với lượng glutathione,
tổng superoxide dismutase, catalase hoạt động và glutathione peroxidase tương đối
cao. Tất cả những kết quả này được đi kèm cùng những quan sát mô học ở gan. Từ
đó, cho thấy cả nước hoa quả và dấm lên men từ Hovenia dulcis đều có tác dụng
trong việc làm giảm các tác dụng phụ của rượu [37].
Năm 2012, Minchun Wang và đồng sự cũng đã chứng minh được tác dụng
bảo vệ gan do ngộ độc rượu cấp tính của các thành phần polysaccharide - chủ yếu
gồm galactose, arabinose, rhamnose và acid galacturonic - trong cuống quả Hovenia
dulcis. Dịch chiết Hovenia dulcis làm giảm đáng kể nồng độ AST, ALT trong huyết
thanh, giảm đáng kể mức độ của MDA trong gan và phục hồi đáng kể các hoạt động
của các enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn
thương gan do rượu [38].
Mới đây nhất, năm 2015, các nghiên cứu ở Đại học Shaanxi Normal, Trung
Quốc đã được tiến hành để tìm hiểu tác dụng bảo vệ của myricetin (MYR) tinh chế
từ Hovenia dulcis Thunb. về chống rối loạn chức năng nội mô mạch máu và tổn
thương gan ở chuột sử dụng nước chứa 3% choline. MYR đã được chứng minh là
có hoạt động thu dọn các gốc DPPH˙, HO
-
, và O
2
˙ mạnh mẽ. Sử dụng liên tục MYR
người ta thấy rằng: Dịch chiết từ cuống quả Hovenia dulcis Thunb. (HDT) sử dụng
bằng đường uống làm tăng thời gian bơi đáng kể so với nhóm chuột đối chứng.
Điều này là do HDT làm giảm đáng kể nồng độ hormon stress như cortisol, hormon
kích thích thượng thận ACTH (adrenocorticotropic hormone). Nồng độ của acid
thiobarbituric đã đột ngột giảm trong cơ bắp cẳng chân ở cả liều 100 mg/kg và 200
mg/kg của HDT so với nhóm chuột đối chứng. Đồng thời HDT làm gia tăng đáng
kể các tác nhân chống oxy hóa trong gan như superoxide dismutase. Ngoài ra, HDT
làm giảm đáng kể lượng glucose máu, cholesterol toàn phần và triglyceride. Những
kết quả này gợi ý rằng HDT đã có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động
thể chất đáng kể thông qua tác dụng chống căng thẳng và chống oxy hóa [32].
1.3.1.4 Tăng cường miễn dịch
Theo một nghiên cứu in vitro đánh giá hoạt động miễn dịch, các
polysaccharide trong cuống quả HDT bao gồm chủ yếu rhamnose, arabinose,
galactose và axit galacturonic làm tăng cường đáng kể hoạt động thực bào, sản xuất
oxit nitric và hoạt động acid phosphatase của các đại thực bào phúc mạc, có thể
được đánh giá như một tác nhân điều hòa miễn dịch tự nhiên tiềm năng [39].
11
1.3.1.5 Tác dụng hạ đường huyết
Theo một nghiên cứu đã được công bố trong tạp chí Dược liệu Trung Quốc
năm 2002 cho thấy: Khi sử dụng mô hình gây tiểu đường bởi alloxan và chia chuột
thành 3 nhóm. Một nhóm chỉ đơn thuần gây mô hình, một nhóm điều trị với liều
lượng khác nhau của HDT trong 7 ngày, nhóm còn lại được điều trị tích cực với
glibenclamide. Sau đó, tiến hành đo lượng đường trong máu và glycogen gan. Kết
quả là: nồng độ đường trong máu của những con chuột được điều trị bằng HDT
hoặc glibenclamide thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình. Nồng độ glycogen gan
ở nhóm điều trị bằng HDT liều trung bình hoặc thấp và nhóm glibenclamide được
tăng lên đáng kể. Từ đó thấy rằng HDT có tác dụng hạ đường máu và có thể trở
thành một loại thảo dược chống bệnh tiểu đường hiệu quả [25].
1.3.1.6 Tác dụng chống dị ứng
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: Cuống mang quả và quả của cây Khúng khéng được
thu hái tại Cao Bằng vào tháng 10 năm 2014. Mẫu nghiên cứu được làm
sạch, phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu,
Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu.
- Mẫu thực vật được Th.S Nguyễn Quỳnh Nga và Th.S Hoàng Văn Toán - cán
bộ Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là
Hovenia dulcis Thunb. (Phụ lục 1).
- Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu,
Viện Dược liệu với số hiệu là DL – 050515.
Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng
14
2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
Thiết bị dùng cho nghiên cứu:
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy.
- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60
- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200.
- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng 254 nm và 366 nm).
- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn,
bình cầu, phễu, giấy lọc…
- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino khỏe mạnh, sử dụng cả chuột đực và
chuột cái, trọng lượng từ 20 ± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi
Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103.
Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng
chăn nuôi, Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày
và trong suốt thời gian nghiên cứu theo các tài liệu hướng dẫn thường quy.
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học:
Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phẩn của Khúng khéng
bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric).
Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 98%
chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan,
ethylacetat, n-buthanol. Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất
chính trong các phân đoạn với các thuốc thử đặc trưng.
2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt
trắng bằng Paracetamol bao gồm:
- Tác dụng chống viêm gan cấp.
- Tác dụng chống oxy hóa.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học.
Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu ở nhiệt độ 60
o
C. Tán nhỏ bằng thuyền tán
thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo.
16
Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Khúng khéng bằng
phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [4], [5], [6].
2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM
Phân chia lô thí nghiệm: Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô:
Lô 1 (chứng sinh học): uống nước cất.
Lô 2 (mô hình): uống nước cất + uống PAR 220 mg/kg.
Lô 3 (chứng dương): uống silymarin liều 100 mg/kg + uống PAR 220mg/kg.
Lô 4: uống KKC liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
Lô 5: uống KKC liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
Lô 6: uống KKE liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
Lô 7: uống KKE liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg.
Tiến hành thí nghiệm: Chuột trong các lô được uống nước cất hoặc mẫu thử
hoặc silymarin liên tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Ngày thứ 8,
sau uống nước cất hoặc mẫu thử hoặc silymarin 1 giờ và nhịn đói 16 - 18 giờ trước
đó, gây độc cho chuột ở tất cả các lô (trừ lô chứng sinh lý) bằng uống PAR liều 220
mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g.
Phương pháp đánh giá: 24 giờ sau khi gây độc bằng PAR, lấy máu động
mạch cảnh của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt cổ, ly tâm lấy huyết
thanh để định lượng enzym ALT, AST. Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng,
định lượng MDA dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử.
Nguyên lý phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl
dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế
bào gan. MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng
và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm.
Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan
Copyright: Tài liệu đại học ©