BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ THỊ THU HIỀN
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 173.113
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths. Võ Thị Thu Thủy –
người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành
khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang
giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã
tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện
nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh
khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để
khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Lê Thị Thu Hiền 1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh …………………………… 15
1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên
Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus …………………… 15
1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất
Leptomycin bởi electroporation …………………………………….16
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… ……… 17
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………………….17
2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17
2.1.2 Máy móc và thiết bị ………………………………………………….19
2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………….19
2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ……………………………………………… 19
2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ……………………………………… 20
2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được …………………………20
2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20
2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20
2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ……… 20
2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21
2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22
2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23
2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24
2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ……………………… 25
2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………………….25
2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………… 26
Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S.A Staphylococcus aureus
P. mirabilis Proteus mirabilis
ADN Acid deoxyribonucleic
ARN Acid ribonucleic
DMHC Dung môi hữu cơ
ĐB1 Đột biến lần 1
ĐB2 Đột biến lần 2
G (-) Gram âm
G (+) Gram dương
HTKS Hoạt tính kháng sinh
IR Hồng ngoại - Infrared
KS Kháng sinh
MC Mẫu chứng
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
SKLM Sắc ký lớp mỏng
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TB Tế bào
TĐC Trao đổi chất
UV Tử ngoại – Ultraviolet
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) 2
Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh 4
Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 6
Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 8
Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn …………………… 13
Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis………… 34
Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35
Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36
Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch.
Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV.
Hình P4: Sắc kí lớp mỏng.
Hình P5: Sắc kí cột.
Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được.
Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng
vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử
ngành y – dược. Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị
Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander
Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh
Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940. Ngay
sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh
trong chiến tranh thế giới thứ II.
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều KS mới được xác định
hầu hết từ các xạ khuẩn, và đó là thời kỳ “ vàng son” của hóa liệu pháp KS( Hình
1.1)
Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng KS trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm
giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ những từ 1980 số kháng sinh
mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm
thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trang đáng báo động là ngày càng
tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc
kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới.
Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc
tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện.
Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có
cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và
cephalosporin…
1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh
Định nghĩa
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự
nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách
Quinolon
Floxacin, Levofroxacin…
Cotrimoxazol
Cotrimoxazol…
1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc
điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó. (Hình 1.2)
Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp
khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV,
làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác
dụng lên các đích khác nhau. [18]
Có 6 kiểu chủ yếu: [18]
- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào.
- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất.
- Tác dụng lên sự tổng hợp AND.
- Tác dụng lên sự tổng hợp protein.
- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp.
- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh
Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình
1.3. [11]
được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức
ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt[11].
Trong trồng trọt: Kháng sinh đã được sử dụng để tiêu diệt các bệnh của cây
trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Vandamycin dùng để diệt nấm
Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].…
Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp giúp giảm thời gian khử trùng bằng
nhiệt, nhiệt độ khử trừng giảm xuống là cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các
vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do
Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis). [11].
1.2 Đại cương về xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những VK thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi
trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ
chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.
Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%. [4, 18]
Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như
KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất
nhiều. [7, 19]
1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ
sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ
khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô
ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. [7, 19]
Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3
μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết
triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển
dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ
xuất hiện các chuỗi bào tử. [7] Chuỗi bảo tử (sợi bào tử ) có rất nhiều hình dạng
khác nhau : thẳng, sóng, móc câu, xoắn…chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử
trần, là sơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn,
nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc. [7, 12]
Đặc điểm sinh lý:
Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng
phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời
thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-
30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]
Khả năng tạo sắc tố:
Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của
khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7, 12]
Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa
phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình
Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử
dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Khóa phân loại
này dựa trên các đặc điểm sau:
- Màu của khuẩn lạc.
- Màu của khuẩn ty cơ chất.
- Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan.
- Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử.
- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon. - Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh
sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV
có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới màng nhân.
- Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian
chiếu, cường độ bức xạ.
- Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục
hoạt (photoreactivation): Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài
ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được
phục hồi.
• Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu.
Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến , phần lớn các VSV ch ết.
Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS tăng
(đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm ). Cần chọn lọc ra
những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp.[ 11 ]
1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn
Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái
hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ
thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ. [14, 16]
Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng
VSV:
- Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền
sang môi trường mới),
- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)
- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm
khô mẫu đông lạnh)
hỏi thiết bị phức tạp.
Nhược điểm: Khó cơ giới hóa , tự động hóa , khó vô trùng , tốn diện
tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp.
Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong môi
trường lỏng
Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình,
tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao.
Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.
Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung,
lên men bán liên tục, lên men liên tục.
Có 4 kiểu lên men chìm như sau:
- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên
men với 1 thể tích MT xác định. VSV phát triển theo giai đoạn và tạo
ra sản phẩm. Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.[11]
- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi
trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên. Do
đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men. [11]
- Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã
phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch
lên men và bổ sung thêm MT mới vào bình. [11]
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT
dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà
định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định. [11]
1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực
tiếp của các ion H
Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Tùy theo đặc tính của
loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB . Để thu lấy các
chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp.
Một số phương pháp chiết tách thường dùng:
- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ.
- Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên
cột…).
- Phương pháp tạo phức kết tủa.
- Phương pháp chưng cất.
- Phương pháp thăng hoa.
Chiết xuất: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn
hợp. Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một
pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng
lỏng- lỏng, thường một pha là nước).
Phương pháp sắc ký:
- Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một
hỗn hợp nhiều thành phần. Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa
tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không
hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn. Các
chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác
nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di
chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải
trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng.
- Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng
lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính
chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
1.6.2 Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó
đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi
trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan
giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ
để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc
trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR.
1.6.3. Khối phổ (MS)
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)
được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Dùng chùm điện
tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ trong chân
không cao (10
-6
mmHg). Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ
thành mảnh. Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số
vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ. Dựa vào khối
phổ có thể định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và
định lượng các chất.
1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh
1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin
từ Streptomyces hygroscopicus.
Rapamycin được biết là có các chức năng của là một loại kháng sinh và ức chế
miễn dịch, gần đây nó cũng đã được công nhận là có khả năng làm chậm quá trình
lão hóa. Những ảnh hưởng của oxy hòa tan (DO) mức sản xuất rapamycin dạng
viên của Streptomyces hygroscopicus
đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này.
Kết quả cho thấy một mức độ DO cao là cần thiết để tăng cường sản xuất
rapamycin. Tuy nhiên, tiền đề để có được một sự tập trung rapamycin cao bằng
cách sử dụng kiểm soát DO đã được giữ nguyên vẹn trong dạng viện của S.
thành công của Streptomyces sp. ATCC 39.366, và sẽ tạo điều kiện cho việc xây
dựng một loại trực tiếp đột biến gen trong Streptomyces sp. ATCC 39.366 để sản
xuất hàng loạt các dẫn xuất leptomycin mới. [19]
Copyright: Tài liệu đại học ©