BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN

khóa luận.
Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn và kiến thức của bản thân còn hạn chế
nên khóa luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến
của các thầy cô và các bạn để khóa luận được chỉnh sửa và hoàn thiện hơn nữa.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014.
Sinh viên
Nguyễn Nguyệt Minh
Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh. 2
1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh. 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh. 2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh. 3
1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh. 3
1.2. Đại cương về xạ khuẩn. 5
1.2.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces. 5
1.2.2. Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7
1.2.3. Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. 7
1.3. Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn. 8

2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được. 20
2.3. Phương pháp thực nghiệm. 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên 21
2.3.4. Đột biến 22
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ. 24
2.3.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24
2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay. 25
2.3.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25
2.3.10. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết. 25
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh khiết thu được. 25
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 26
3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26
3.2. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1. 26
3.3. Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2. 28
3.4. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29
3.4.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất. 29 3.4.2. Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất. 30
3.5. Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. 31
3.6. Kết quả sắc ký cột. 32
3.6.1. Sắc ký cột lần 1. 32
3.6.2. Sắc ký cột lần 2. 34
3.6.3. Sắc ký cột lần 3. 36
3.6.4. Hiệu suất quá trình tách và tinh chế kháng sinh. 37
3.7. Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được. 37
3.7.1. Chất tinh khiết 1. 37

L-DAP L-diaminopimelat acid
MS Mass spectrometry (Phổ khối)
MT Môi trường
MTdt Môi trường dịch thể
P. mirabilis Proteus mirabilis
RAPD Random amplified polymorphic DNA
(ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)
S. aureus Staphylococcus aureus
SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên
TK Tinh khiết
UV Ultraviolet (Tử ngoại)
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng Nội dung
Bảng 1.1
Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học
Bảng 1.2 Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp
Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định
Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định
Bảng 2.3 Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn
Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng
Bảng 3.1
Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Phụ lục 4 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên
Phụ lục 5 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1
Phụ lục 6 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2.

Phụ lục 7 Phổ UV của chất tinh khiết 1
Phụ lục 8 Phổ UV của chất tinh khiết 2
Phụ lục 9 Phổ IR chất tinh khiết 1 Phụ lục 10 Phổ IR chất tinh khiết 2
Phụ lục 11 Phổ khối chất tinh khiết 1
Phụ lục 12 Phổ khối chất tinh khiết 2
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là cơ hội cho nhiều loại bệnh
phát triển, đặc biệt là nhóm bệnh do vi khuẩn gây ra. Nhưng khí hậu Việt Nam đồng
thời cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một hệ sinh thái vô cùng đa
dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài vi sinh vật hữu ích.
Kháng sinh là hoạt chất có tác dụng sinh học rất mạnh, được tổng hợp từ vi
khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm hoặc từ một số thực vật bậc cao. Sự phát minh ra kháng
sinh là một thành tựu rực rỡ, mở ra một kỷ nguyên mới của nền y học trong điều trị
các bệnh nhiễm khuẩn. Những viên thuốc nhỏ bé đã góp phần chống lại bệnh tật do
vi khuẩn gây ra và bảo vệ sức khỏe cho con người.
Nghiên cứu để sản xuất ra kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật luôn là đề tài
hấp dẫn các nhà khoa học. Trong số hơn 15000 kháng sinh đã được biết đến hiện
nay trên thế giới thì khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó chủ yếu là do chi
Streptomyces sản xuất. Đây là một chi xạ khuẩn lớn, có nhiều tiềm năng sinh tổng
hợp kháng sinh và đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới tập trung
nghiên cứu.

Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể
Beta lactam + Penicilin: Benzylpenicilin, Oxacilin
+ Cephalosporin: Cephalexin, Cefotaxim
+ Các betalactam khác: Carbapenem, Monobactam, Chất
ức chế betalactamase.
Aminoglycosid Streptomycin, Gentamicin
Macrolid Erythromycin, Clarithromycin
3

Lincosamid Lincomycin, Clindamycin
Phenicol Cloramphenicol, Thiamphenicol
Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid + Glucopeptid: Vancomycin
+ Polypeptid: Polymycin
Quinolon Acid nalidixic, Ciprofloxacin
Co-trimoxazol Co-trimoxazol

1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh.
+ Trong y học: Kháng sinh lần đầu được sử dụng trong y học là penicillin vào năm
1943. Sau đó 1 loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra để điều
trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, góp phần nâng tuổi thọ con người lên.
+ Trong thú y: để điều trị các bệnh nhiễm trùng của động vật.
Ví dụ: Griseoviridin chữa bệnh viêm phổi cấp, viêm vú của trâu, bò.
Metimycin dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra.
+ Trong nông nghiệp: để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng.
Kháng sinh còn được dùng kích thích hạt nảy mầm.
Ví dụ: Griseofulvin dùng chống lại bệnh do Botrytis gây ra (bệnh rỉ sét ở lúa mì).
+ Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng bổ sung vào thức ăn nhằm kích thích tăng
trọng: Terravit, Biovit, Monenzin
+ Trong công nghiệp thực phẩm: để bảo quản thực phẩm đóng hộp [5].

Đóng gói
Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm
nghiệmnghiệm nghiệm
Nhân giống quy mô thí nghiệm
Nhân giống trong thiết bị nhân giống
Lên men tổng hợp kháng sinh
Dịch lên men
Sinh khối
Dịch chiết sinh khối
Dịch lọc
Dịch chiết
Sản phẩm tinh chế
Sản phẩm đã được kiểm nghiệm
Sản phẩm đóng gói
5

1.2. Đại cương về xạ khuẩn.
Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các Gr
(+), có tỷ lệ G + C >55%.
Đại đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi
phân nhánh. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có
khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn.
Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulase,
protease, glucoizomerase ) cũng như các hợp chất khác.
1.2.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces.
a) Đặc điểm của chi Streptomyces [6], [8].
+ Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2 µm.
+ Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi
bào tử. Ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Bào tử không có
khả năng di động.

sử dụng rộng rãi để để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ
Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử
dụng bao gồm:
Màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan,
hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, tiêu thụ đường arabinose, tiêu thụ đường
xylose, tiêu thụ đường inositol, tiêu thụ đường mannitol, tiêu thụ đường fructose,
tiêu thụ đường rhamnose, tiêu thụ đường saccarose, tiêu thụ đường raffinose.
7

+ Ngày nay việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại xạ
khuẩn đã và đang được áp dụng, nhất là ở các phòng thí nghiệm tiên tiến.
1.2.2. Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có
cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng
hợp được thì có tới 60% là từ Streptomyces.
Bảng 1.2 giới thiệu một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp [6], [10].
Bảng 1.2: Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp
Kháng sinh Chủng sinh tổng hợp Phổ tác dụng
Actinomycin D S. antibioticus Ung thư
Adriamycin S. peuceticus Ung thư
Kanamycin S. kanamyceticus Gr(-)
Acid clavulanic S. clavuligerus Gr(+)
Amphotericin B S. nodosus Nấm
Cloramphenicol S. venezuelae Gr(+)
Nystatin S. noursei Nấm

1.2.3. Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh. Một

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong các ống
giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30 % các cá thể
khác.
9

Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu
tiếp.
Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên
cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất [5].
b) Đột biến nhân tạo
Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:
+ Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ, dimethylsulphat, hydroxylamin.
+ Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vật lý hay được
dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng
cách đột biến, thời gian và cường độ bức xạ.
+ Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon
Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết
chết hầu hết các VSV. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm
thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh
(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột
biến dương) [12].
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn.
Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo quản
giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng, không chỉ ở trung tâm giữ giống quốc gia mà
ngay ở các phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết.
Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ thuật
cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định
và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác.
Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:
+ Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh 2

b) Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến
c) Nhược điểm: tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ giới hóa
tự động hóa.
d) Ứng dụng: chỉ sử dụng trong chọn giống và giữ giống trong phòng thí nghiệm
[7]
11

 Phương pháp lên men chìm.
a) Đặc điểm: VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng. Phương
pháp này dùng cho cả VSV hiếu khí và kị khí. Đối với VSV kị khí trong quá trình
lên men không cần sục khí, còn VSV hiếu khí thì phải vừa khuấy trộn vừa sục khí
liên tục.
b) Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm
mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa.
c) Nhược điểm: phải có thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư lớn, đòi hỏi phải làm
trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.
d) Phân loại: Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính
+ Lên men mẻ
+ Lên men có bổ sung
+ Lên men liên tục
+ Lên men bán liên tục [7].
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh
1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh.
Đây là giai đoạn rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên
men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp.
Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất và tinh chế sản phẩm đạt được
các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị. Công đoạn tinh chế sẽ góp
phần quyết định tới giá thành của sản phẩm [5].
1.5.2. Chiết xuất.
+ Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách

, E
2
. Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước
sóng hay số sóng là phổ tử ngoại [4].
13

+ Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn,
liên kết bội, hệ thống thơm… hay cặp electron tự do không tham gia liên kết của O,
N, S [2].
1.6.2. Phổ hồng ngoại (IR)
+ Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi
qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau.
+ Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và
thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR. Có mối tương
quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp
thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó. Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ
đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR.
+ Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thông thường là
600-4000 cm
-1
[2].
1.6.3. Phổ khối (MS)
+ Phổ khối là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị
bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối
lượng của carbon
12
C) hoặc bằng Dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên
tử hydro).
+ Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ

S.flexneri, S.typhi [14].
1.8. Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự
sản xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp. JAJ06.
Streptomyces sp. JAJ06 là chủng sản xuất kháng sinh phụ thuộc nước biển,
trước đây được phân lập và mô tả từ ruộng muối ven biển Ấn Độ. Bài báo này báo
cáo sự thay thế nước biển bằng một công thức muối được xác định trong môi trường
sản xuất, sau đó tối ưu hóa phương tiện thống kê để đảm bảo phù hợp cũng như cải
thiện sự sản xuất kháng sinh bởi Streptomyces sp. JAJ06. Chủng xạ khuẩn này được
15

quan sát kĩ để sản xuất hợp chất kháng sinh với công thức hóa học hợp nhất của
muối natri clorua thay vì nước biển trong môi trường sản xuất .
Thí nghiệm thiết kế Plackett-Burman đã được áp dụng, và ba thành phần, tinh
bột, KBr và CaCO3, được công nhận là có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất kháng
sinh của Streptomyces JAJ06 ở mức độ riêng rẽ. Sau đó, phương pháp bề mặt đáp
ứng với thiết kế Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa các thành phần ảnh
hưởng này nhằm cải thiện việc sản xuất kháng sinh của Streptomyces sp. JAJ06.
Tổng cộng có 17 thí nghiệm đã được tiến hành với việc xây dựng một mô hình bậc
hai và một phương trình đa thức bậc hai. Mức độ tối ưu của các thành phần trung
bình thu được từ việc phân tích các mô hình và phương pháp tối ưu hóa số học. Khi
chủng JAJ06 được nuôi trong môi trường tối ưu hóa, hoạt tính kháng sinh đã tăng
lên đến 173.3 U/ml, tăng 26,8% so với ban đầu (136,7 U/ml). Nghiên cứu này tìm
ra một cách hữu hiệu để nuôi cấy Streptomyces sp. JAJ06 nhằm tăng cường sản xuất
các hợp chất kháng sinh [18].
1.9. Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp. với hoạt tính kháng
khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran.
Từ 140 chủng phân lập được thu thập từ khắp miền tây bắc của Iran, 12 chủng
phân lập Streptomyces biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao với tác nhân vi khuẩn
được phân loại qua PCR để xác định trình tự gen 16 rDNA và phân tích mẫu ADN
đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).