BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA
NUCIFERIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công
nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực – Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thiện được đề
tài nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
quá trình học tập ở trường.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các
bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công
nghiệp dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn
đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc.

Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên
Nguyễn Đắc Tùng
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây 3
1.1.1 Cây sen 3
1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen 4
1.1.2.1 Chiết xuất 4
1.1.2.2 Tinh chế và phân lập. 5
1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây 6
1.2 Hợp chất Nuciferin 6

2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22
2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 22
2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm 23
2.4.3 Thử tác dụng sinh học 23
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. 24
3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 24
3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 24
3.1.2 Tinh chế Nuciferin. 24
3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin
(N-methyl-asimilobin, II) 24
3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr 24
3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI 27
3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid 27
3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) 28
3.3.1 Sử dụng môi trƣờng NaOH loãng 29
3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K
2
CO
3
31
3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K
2
CO
3
31
3.3.4 Đề xuất quy trình 32
3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp 34
3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid
(II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V) 37

Methanol
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
SN
2

Phản ứng thế ái nhân lƣỡng phân tử (Nucleophilic Substitution)
SOD
Superoxid
t
o
nc

Nhiệt độ nóng chảy

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.
Một số alkaloid trong lá sen…………………………………………
4
Bảng 2.1.
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm
19
Bảng 2.2.
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm…………
20
Bảng 3.1.
Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán
tổng hợp (II)…………………………………………………………
26
Bảng 3.2.

Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD………
39
Bảng 3.10.
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và
IC
50
của mẫu thử……………………………………………………
40
Bảng 3.11.
Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC
50

của mẫu thử…………………………………………………………….
40

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)…………………………………….
3
Hình 2. Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen ……………… …
4
Hình 3. Công thức cấu tạo của nuciferin ………………………………………
6
Hình 4. Công thức cấu tạo nhân aporphin………………………………………
7
Hình 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin………………………………
11
Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin……….
12
Hình 7. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF…………
12

Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi CH
3
CN ……
16
Hình 17. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi DMF …………
17
Hình 18. Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trƣờng NaOH loãng………………….
17
Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%
25
Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin.
26
Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin
26
Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin………
28
Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin…………………
29
Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa………………
30
Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa……………….
31

chống ung thƣ [36], chống HIV [41], chống tăng lipid máu [36], hay có tác
dụng chống oxy hóa mạnh [37].
Nhờ có ƣu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng nhƣ là tiềm năng của
nó trong y dƣợc học, cây sen trong những năm gần đây đƣợc đƣa vào nghiên
cứu rất nhiều ở Việt nam. Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách
2

chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là
một hƣớng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh. Đề tài
“Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin” đƣợc
thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin.
2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn chất bán tổng hợp đƣợc.
3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây
1.1.1 Cây sen
Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae.
Phân bố: Vùng nhiệt đới
châu Á, Châu Mĩ và ở Việt
Nam.
Đặc điểm thực vật: Cây
mọc dƣới nƣớc, sống nhiều
năm. Thân rễ hình trụ mọc bò
lan trong bùn, lá hình tròn mọc
lên khỏi mặt nƣớc, cuống dài có
gai, đính ở giữa phiến lá, mép lá
uốn lƣợn tròn. Hoa to màu hồng
hay trắng có mùi thơm. Nhiều

o
. Dịch
chiết cồn đƣợc cất dƣới áp suất giảm để thu hồi cồn. Hòa tan cắn vào nƣớc,
acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2. Lọc loại bỏ cặn. Dịch lọc acid đƣợc chiết
bằng ether dầu hỏa để loại tạp. Dich chiết acid đƣợc thêm NH
4
OH 10% đến pH
Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen
Một số Alkaloid
R1
R2
R3
Nuciferin
CH
3

CH
3

CH
3

N – nor – Nuciferin
CH
3

CH
3

H

- Phƣơng pháp chiết bằng cồn: Bột lá sen đƣợc chiết bằng cồn lạnh trong
4 ngày. Dịch chiết đƣợc cô thành cắn dƣới áp suất giảm. Sau đó hỗn hợp đƣợc
chiết cân bằng giữa 2 pha CHCl
3
và dung dịch NH
4
OH 5%. Lấy pha hữu cơ,
rửa lại bằng nƣớc, lắc vài lần với HCl 2N vài lần (pha acid sẽ lấy đi tạp dạng
dầu màu nâu). Pha CHCl
3
đƣợc cô ở áp suất giảm thu đƣợc cặn, nghiền nhỏ
trong dung dịch NH
4
OH ấm sau đó chiết bằng CHCl
3
. Lấy pha hữu cơ, làm
khan, cô dƣới áp suất giảm thu đƣợc cắn alkaloid toàn phần [6, 11].
1.1.2.2 Tinh chế và phân lập.
- Phân lập alcaloid bằng sắc kí cột sử dụng silica gel 60 GF254(Merck):
Hoạt hóa silica gel ở nhiệt độ 110
o
C trong 1 giờ. Lắc silica gel với hệ
dung môi đã chọn thành hỗn dịch, rót từ từ vào cột, sau đó cho dung môi chảy
qua liên tục với thời gian là 5 giờ để ổn định cột. Cắn alkaloid toàn phần ở
trên đƣợc hòa vào một lƣợng nhỏ với hệ dung môi đã chọn tạo thành dịch
alkaloid đậm đặc rồi trộn với một lƣợng silica gel vừa đủ đƣa vào cột sắc kí đã
chuẩn bị ở trên. Rửa giải bằng hệ dung môi đã chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng
dần. Tốc độ chảy khoảng 30 giọt/phút, hứng mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào
các ống nghiệm riêng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng. Chọn riêng các phân
đoạn chỉ có một vết trên sắc kí đồ, bốc hơi dung môi thu đƣợc cắn alcaloid.

ích mẫu; chế phẩm thuốc an thần Seroga của xí nghiệp dƣợc phẩm Trung ƣơng
25 chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao táo nhân và cao thiên ma.
1.2 Hợp chất Nuciferin
1.2.1 Công thức, tính chất
- Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
2
.
- Khối lƣợng phân tử: 295,2.
- Danh pháp: 5,5a,7,8-tetrahydro-1,2-
dimethoxy-6-methyldiabenzoquinolin (IUPAC)
[2,3]; hoặc 1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-
tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin; 1,2-
dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H-
dibenzo[de,g]quinolin; (+-)-1,2-dimethoxy-6-
methyl-aporphin; 1,2-dimethoxy-6-methyl-aporphin
[12].

Hình 3. Công thức
cấu tạo của nuciferin
7

- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu
vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl
3
, MeOH, EtOH nóng, hầu
nhƣ không tan trong nƣớc, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165

11
-H) [3,11,12].
1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu
- Chiết xuất: Sủ dụng phƣơng pháp chiết nhƣ phần 1.2.2.1 thu đƣợc
alkaloid toàn phần.
- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại trong cồn nóng
thu đƣợc tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt.
1.2.3 Tác dụng dược lý.
1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid)
Trong những năm gần đây, tác dụng của các
alkaloid có nhân aporphin đang là chủ đề của rất
nhiều nghiên cứu bởi mối liên hệ với cấu trúc
nhân apomorphin cũng nhƣ là các tác dụng không
thể không thừa nhận của các bài thuốc y học cổ
truyền có chứa những alkaloid trên, chính vì thế
nhiều nghiên cứu về các aporphinoid đã đƣợc thực
hiện. Sau đây là một số tác dụng đƣợc lý chung
của các aporphinoid đã đƣợc tìm thấy:
- Tƣơng tác với các receptor thuộc hệ dẫn truyền thần kinh.
- Tác dụng gây co cơ.
- Ảnh hƣởng đến hoạt động của nhiều enzym.
- Tác dụng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do.
Hình 4. Công thức cấu
tạo nhân aporphin
8

- Ảnh hƣởng đến quá trình kết tập tiểu cầu.
- Hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim.
- Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus.
- Gây độc tế bào và tác dụng chống khối u.

µg/ml. Các giá trị IC
50
ở trên đều ít hơn so với giá trị IC
50
ở rutin trong thử tác
9

dụng chống oxy hóa với các phƣơng pháp tƣơng tự. Ngoài ra, ngƣời ta đánh
giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ , không thấy có dấu
hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lƣợng cơ thể. [37].
- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid đƣợc chiết
đƣợc từ lá sen đã đƣợc thử nghiệm. Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã
đƣợc thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống
nấm. Tuy nuciferin không có tác dụng này, nhƣng ngƣời ta phát hiện ra một
mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1
và C2 trên vòng aporphin (hình 5). Đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới
với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [40].
- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích
tiết insulin in vitro tốt hơn Glyburid. Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách
đóng các kênh K
+
- ATP , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đƣờng của
Nelumbo nucifera [27,28].
- Dịch chiết ethanol của sen có tác dụng chống béo phì ở ngƣời, đồng thời
có tác dụng chống béo phì và chống oxy hóa ở chuột đƣợc cho ăn một chế độ
giàu chất béo [19].
- Dịch chiết lá sen có đặc tính ức chế mạnh CYP2D6 in vitro (CYP2D6 là
một enzyme trong hệ thống Cytochrome P450 có liên quan đến chuyên hóa các
thuốc trong cơ thể). Kết quả cho thấy dịch chiết cồn ức chế mạnh mẽ CYP2D6
với giá trị IC

nucifera, Nymphaeaceae) đã đƣợc chứng minh là có tác dụng ức chế hoạt động
tạo của khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột. Trong số các thành phần phân
lập đƣợc, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và 2-hydroxy-1- methoxy-
6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methyl-asimilobin ức chế
sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, N- methyl-asimilobin
ức chế sự biểu hiện của TRP -1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế
sự biểu hiện của TRP- 2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [15].
11 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin
- Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế
acetylcholinesterase và theo điều tra ban đầu thấy có một mối tƣơng quan giữa
cấu trúc và tác dụng: N-methyl-asimilobin (1), một cất ức chế mạnh
acetylcholinesterase (AChE), cùng với hai alkaloid aporphin có tác dụng kém
hơn là nuciferin (2) và nornuciferin (3) đƣợc tách ra từ Nelumbo nucifera. N-
methyl-asimilobin (1) ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2
µg ml
-1
trong khi giá trị IC
50
tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002
µg ml
-1
.[17].
1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa
1.3.1 Phương pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether
A. Phương pháp thế ái nhân
a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kirschk và cộng sự
(1995)

Hình 8. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl
3
trong CH
3
CN
b. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Horie và cộng sự (1975)
Điều kiện phản ứng: Giống nhƣ phản ứng của Parker và đồng sự, ở đây
tác giả sử dụng AlBr
3
trong dung môi

CH
3
CN [18].
13 Hình 9. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr
3
trong CH
3
CN
C. Phương pháp base trên một acid Bronsted
a. Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Li và cộng sự (2000)
Điều kiện phản ứng: phản ứng diễn ra trong môi trƣờng H
2
SO
4
ở nhiệt
độ 70

(1970) Hình 13. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF
Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxide (lƣợng gấp 2,6-
2,7 số mol của nuciferin) vào dung môi DMF đun hồi lƣu (sục N
2
) ở nhiệt độ
100
o
C trong 3 giờ. Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản
phẩm monodemethyl nuciferin với hiệu suất khoảng 94-98% [14,26].
b. Phƣơng pháp didemethyl hóa nuciferin của Neumeyer và cộng sự
(1973)

Hình 14. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac
2
O
Tiến hành phản ứng: 4g Nuciferin, 6 ml HI 57% và 4,5 ml Ac
2
O đƣợc
làm nóng ở 140
o
C trong 30 phút. Kết thúc phản ứng: Xử lý thu đƣợc sản phẩm
didemethyl nuciferin (hiệu suất 82%) tinh thể hình kim không màu, t
o
nc

H
18
BrNO
2
) [23].
1.4 Các phƣơng pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol
2-cloroethanol là một tác nhân alkyl hóa quan trọng, đặc biệt nhất là tác
nhân để tạo ra nhiều thuốc chống ung thƣ nhƣ Clorambucil, Melphalan,…
Một ví dụ quan trọng khác là Troxerutin – một hoạt chất có ý nghĩa quan
trọng trong điều trị suy tĩnh mạch mạn tính, là sản phẩm của quá trình O-alkyl
hóa rutin bằng tác nhân 2-cloroethanol.
Dƣới đây là một số phản ứng quan trọng có cơ chế tƣơng tự với phản
ứng O-alkyl hóa tạo dẫn chất của nuciferin:
1.4.1 Phương pháp sử dụng K
2
CO
3
trong dung môi acetonitril

Cho vào bình cầu nguyên liệu, dung môi acetonitril. Thêm vào tác nhân
2-chloroethanol và xúc tác K
2
CO
3
. Đun hồi lƣu phản ứng trong 18 giờ.
Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%
Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K
2
CO
3