BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG
OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG
LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG
OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG
LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG

năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi.

Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2014
Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………………
3
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU……………………………
3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố…………………………………………….
3
1.1.2. Thành phần hóa học………………………………………………………
4
1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng………………………………………….
5
1.1.3.1. Tác dụng sinh học………………………………………………………
5
1.1.3.2. Công dụng………………………………………………………………
5
1.2. OXOSTEPHANIN………………………………………………………….

2.1.1. Hóa chất và dụng cụ……………………………………………………
17
2.1.1.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm……………………………………….
17
2.1.1.2. Hóa chất………………………………………………………………
18
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………
18
2.2.1. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………
18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………
18
2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng……………………………………
18
2.2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây…………….
23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………………………………
24
3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM………………………………………………
24
3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC……………………….
24
3.1.1.1. Xử lý mẫu thử………………………………………………………….
24
3.1.1.2. Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn……
25
3.1.1.3. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC…………………………….
26
3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………
26

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

GACP
Good Agricultural and Collection Practices
IR
Infrared Radiation
HPTLC
High Performance Thin Layer Chromatigraphy
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
MS
Mass spectrometry
NMR
Nuclear magnetic resonance
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
STT
Số thứ tự

34
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cụm hoa đực và hoa đực……………………………………………
3
Hình 1.2. Cụm hoa cái…………………………………………………………
3
Hình 1.3. Quả xanh và hạt……………………………………………………….
4
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của oxostephanin…………………………………
6
Hình 2.1. Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội………………….
14
Hình 2.2. Củ loài S. dielsiana……………………………………………………
15
Hình 2.3. Thân lá non loài S. dielsiana………………………………………….
15
Hình 2.4. Thân lá bánh tẻ loài S. dielsiana……………………………………
15
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú, trong đó có khoảng 4000 loài
thực vật có thể làm thuốc trong các nền Y học dân gian, 800 loài thường được dùng
trong Y Học cổ truyền chính thống và 300 loài dùng trong công nghiệp dược [40].
Như vậy có thể thấy tiềm năng về cây thuốc ở Việt Nam còn rất lớn. Nghiên cứu để
tìm ra cây thuốc mới cùng những hoạt chất mới từ dược liệu là việc làm cần thiết để
nâng cao giá trị sử dụng cũng như phát triển nền Y học cổ truyền Việt Nam.
S. dielsiana Y. C. Wu là một loài Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam,
thường được gọi là củ dòm hay củ gà ấp [24]. Người dân địa phương tại Ba Vì
thường dùng cả củ và thân lá để điều trị tê thấp đau nhức, đau dạ dày. Oxostephanin
một alkaloid quan trọng đã được phân lập từ củ và lá loài S. dielsiana Y. C. Wu
trồng ở Ba Vì, Hà Nội [11], [17]. Hoạt chất này sau đó đã được thử tác dụng gây
độc trên 3 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-2), phổi (LU) và màng tim (RD)
cho kết quả IC
50
lần lượt là: 0.566; 0.755 và 1.404 [22]. Một số nghiên cứu trên thế
giới cũng đã chứng minh oxostephanin có tác dụng trên 2 dòng tế bào ung thư là
ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC) [35]. Với
những kết quả trên có thể thấy tiềm năng phát triển của loài S. dielsiana là rất lớn.
Hiện nay chúng tôi đã tiến hành trồng và theo dõi sự phát triển của loài cây này tại
Ba Vì (Hà Nội), với định hướng trồng phát triển một loài cây thuốc mới theo hướng
“Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc (GACP)” của tổ chức Y Tế Thế Giới
(WHO).
Chính vì vậy, nghiên cứu hàm lượng oxostephanin tích lũy trong cây, đặc
biệt là đánh giá hàm lượng của alkaloid này ở các bộ phận khác nhau của cây có ý
nghĩa quan trọng để xác định bộ phận thu hái, thời điểm thu hái phù hợp. Hoạt động


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Loài S. dielsiana Y. C. Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê
(Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên
(Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
[2], [3], [6], [7].
S. dielsiana Y.C.Wu có tên thường dùng là củ dòm [22], [24], tên khác là
bình vôi nhựa tím, cà tòm ( dân tộc Tày - Tuyên Quang), củ gà ấp [22], [24]. Củ
dòm là dạng cây dây leo nhỏ, sống nhiều năm. Rễ củ to. Thân leo cuốn dài khoảng 3
m. Thân non màu tím hồng nhạt. Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím
hồng [23], [24]. Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành
xim tán kép. Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình
quạt tròn, màu vàng cam. Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô [12]. Cụm
hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu. Hoa nhỏ; đài 1, màu
tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu vàng cam và có các vân tím; bầu hình
trứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi [24].

Hình 1.1. Cụm hoa đực và hoa đực

Hình 1.2. Cụm hoa cái
4

Quả hình trứng đảo, hơi dẹt. Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở
giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [24].

Hình 1.3. Quả xanh và hạt
Loài S. dielsiana Y.C.Wu phân bố nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc. Tại
Việt Nam, loài này phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang,

4
) [33], [34], [38], [39].
Từ loài S.dielsiana thu hái ở Ba Vì (Hà Nội) đã phân lập được 4 alkaloid từ củ là:
L-tetrahydropalmatin, oxostephanin, dehydrocrebanin [17], thailandine [21]. Kết
quả định lượng bằng phương pháp HPLC cho hàm lượng L-tetrahydropalmatin
trong mẫu củ cây 20 tháng tuổi, 34 tháng tuổi và cây trưởng thành lần lượt là
0.035%, 0.33% và 0.4% [11], [17].

5

1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng
1.1.3.1. Tác dụng sinh học
- Nước sắc từ củ loài S. dielsiana phơi khô đem thử tác dụng sinh học trên
động vật thí nghiệm cho thấy với liều 2.5 g và 5 g/kg ttc có tác dụng giảm đau ngoại
biên theo kiểu aspirin, không có tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự
morphin; với liều 50 mg/kg, tác dụng giảm đau đến chậm từ 10-30 phút sau khi cho
chuột uống [17].
- Tác dụng chống viêm cấp được thực hiện trên 2 mô hình: (i) Mô hình gây phù
chân chuột bằng carrageenin: Kết quả cho thấy tác dụng chống viêm cấp của dịch
chiết loài S. dielsiana ở liều 1.5 g và 3 g/kg chỉ có tác dụng sau 24 giờ, tác dụng
chống viêm này chậm, không giống tác dụng của indomethacin với liều 5 mg/kg;
(ii) Mô hình gây tràn dịch màng bụng: củ loài S. dielsiana với liều 1.5 g và 3 g/kg
không có tác dụng. Ở tác dụng chống viêm mạn dùng mô hình gây u hạt, với liều thí
nghiệm 5 g/kg củ loài S. dielsiana có tác dụng làm giảm u hạt, kết quả cho thấy củ
dòm có tác dụng gần tương tự tác dụng chống viêm của prednisolon với liều
5mg/kg. Như vậy củ loài S. dielsiana có tác dụng giảm đau ngoại biên và chống
viêm, tuy nhiên tác dụng này còn phụ thuộc vào liều dùng và thời gian tác dụng
chậm [22].
1.1.3.2. Công dụng
Theo Võ Văn Chi [9], [10], rễ loài được dùng uống, chữa đau lưng, mỏi

7
8
9
10
11
3a
6
6a
6b
7a
11a
11b

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của oxostephanin
1.2.2. Tác dụng dược lý
Nghiên cứu trên thế giới cho kết quả oxostephanin có tác dụng gây độc trên 2 dòng
tế bào là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC)
[43]. Ngoài ra, oxostephanin còn có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư gan
(Hep-2), ung thư phổi (LU) và ung thư cơ vân (RD) [17].
1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
1.3.1.1. Nguyên tắc
- Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp
mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng
thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha
tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha
động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp
và được hút lên bản sắc kí bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên
tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1].
- R

Kieselguhr)…ít được sử dụng [5].
Bảng 1.1. Một số chất làm pha tĩnh cho TLC [5]
Pha tĩnh
Cơ chế sắc ký
Ứng dụng phân tích
Silica
Hấp phụ
Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin
Dẫn chất siloxan
Phân bố
Các chất ít phân cực
Cellulose
Phân bố
Acid amin, carbohydrat, nucleotid
Alumina
Hấp phụ
Hydrocarbon, alkaloid, chất màu thực phẩm,
lipid
Cát biển
Phân bố
Đường, acid béo
Cellulose trao đổi
ion
Trao đổi ion
Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenid
Gel Sephadex
Loại cỡ
Polymer, protein, phức kim loại
- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng cường

. Nếu lượng chất quá lớn,
vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số R
f
gần nhau sẽ chồng lên nhau và
không tách riêng được. Nếu lượng chất quá nhỏ có thể khó phát hiện vết. Lượng
mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0.1 – 50 µg. Tùy theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng
mà thể tích mẫu cũng khác nhau. Trường hợp mẫu đưa dưới dạng điểm, thể tích
mẫu khoảng 1-5 µl; còn trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dạng vạch thì lượng
mẫu đưa lên khoảng 0.1 – 0.2 µl [1], [5].
- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng và mép
của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi bắt đầu đến
điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định. Tốt nhất là cách mép dưới bản mỏng
1.5 cm và cách mép dung môi từ 0.8 - 1cm. Khoảng cách giữa các vết và giữa vết
với mép ngoài bản mỏng tốt nhất nên là 1 cm để tránh hiệu ứng bờ [1], [5].

9

Bước 2: Khai triển sắc ký
- Thiết bị triển khai sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích
thước phù hợp với bản mỏng. Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình
(nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), người ta đặt tờ giấy lọc áp
sát thành bình .
- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô được cho vào bình sắc ký đã bão hòa
pha động. Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm vẫn cách
bề mặt pha động khoảng 1 cm [5].
Bước 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân tích
để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký.
- Sử dụng thuốc thử hiện màu [5]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy đủ nhất tất
cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản
mỏng vào thuốc thử. Đôi khi làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo

8
Polyphenol
NaOH/MeOH, FeCl
3

9
Saponin
VS, AS, hỗn dịch máu
10
Terpenoid
VS, AS (không đặc hiệu)
- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối
hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 hoặc 366 nm. Một số
10

bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh
quang.
- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng
khi soi dưới đèn UV-VIS. Chất phân tích bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký.
Bước 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1].
1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ
thuật SKLM. Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động
như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc
ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết
(TLC Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [39].
Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [14]:
- Khả năng phân tách tốt hơn. Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có
kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng
cũng tốt hơn.

chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng). Sau đó so
sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu
sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu
chuẩn [5].
- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất
định, trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là
không đổi về số vết, về trị số R
f
của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ
lệ tương đối giữa các vết… Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong
công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [5].
Theo kết quả thống kê trong tài liệu [14], SKLM là một trong các tiêu chuẩn
định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển. Dược
điển thảo dược Hoa Kỳ có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010) có 873
chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt Nam IV là 168. Hình ảnh sắc ký
đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu. Ứng dụng này giúp xây dựng “dấu
vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát
hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu.

12

1.3.3.2. Bán định lượng
Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi
soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao),
nếu có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất)
có trong mẫu thử. HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp
so sánh. Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn.
Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của
14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu nghiên cứu là củ và thân lá cây củ dòm (đã được giám định tên
khoa học là Stephania dielsiana Y.C.Wu, tiêu bản được lưu giữ ở phòng Tiêu bản –
Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản là HNIP/17701/10) trồng tại Xã Tản
Lĩnh, Huyện Ba Vì, Hà Nội.

Hình 2.1. Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội
- Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình định lượng: Mẫu củ và thân lá cây trồng
loài S. dielsiana trưởng thành, được thu hái nhiều lần tại các thời điểm khác nhau
trong năm.
- Mẫu nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo các bộ phận khác nhau
của cây, theo tuổi và theo nguồn gốc cây, lấy trên cùng một cây. Các mẫu được thu
15

hái trên các cây trồng từ hạt, trồng từ hom của cây 1 tuổi, 2 tuổi, trưởng thành, thu
hái các bộ phận sau:
+ Mẫu củ.

Hình 2.2. Củ loài S. dielsiana
+ Mẫu thân lá non: phần ngọn cây, dài 50 – 60 cm, lá và thân có màu tím hồng.
Thân mềm nhẵn, kích thước phát triển chưa đầy đủ.