BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN
TRONG GIẢO CỔ LAM
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn
ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện
Bộ môn Dược Liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI -2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ LAN
ĐỊNH TÍNH SAPONIN
TRONG GIẢO CỔ LAM
BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 2
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume 2
1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam 3
1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam 5
1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam 5
1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid 10
1.1.2.3. Các chất khác 11
1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG
CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 12
1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer
chromatography: HPTLC) 12
1.3.2.Camag Reprostar 3 138
1.3.3.Linomat 5.0 14
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BuOH Buthanol
EtOH Ethanol
G Gynostemma
GCL Giảo cổ lam
NXB Nhà xuất bản
SKLM Sắc ký lớp mỏng
5
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B
9
6
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A
10
7
Hình 1.7. Camag reprostar 3
13
8
Hình 1.8. Linomat 5.0
15
9
Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước
18
10
Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366
nm và phun
hai loại thuốc thử hiện màu
22
11
Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum
(Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước
với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai
triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và
phun thuốc thử hiện màu
23
12

33

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.)
Makino
7
2
Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC
12
3
Bảng 3.1. Giá trị R
f
của các vết quan sát được trên sắc ký đồ
của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử
ngoại bước sóng 254 nm
25
4
Bảng 3.2. Giá trị R
f
và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của
các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu
28

trước đây như cảm quan về hình thái, đặc điểm vi phẫu, chỉ thị hóa học… rất
khó để đánh giá chính xác chất lượng Giảo cổ lam. Vì vậy, việc phân tích
thành phần hóa học đặc biệt là thành phần saponin để bước đầu xây dựng tiêu
chuẩn vân tay hóa học của Giảo cổ
lam là rất quan trọng và và có ý nghĩa thực
tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này. Xuất phát từ
yêu cầu thực tế trên, khóa luận
“Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng
sắc ký lớp mỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu:
- Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino.
- So sánh thành phần saponin giữa các loài GCL thuộc chi
Gynostemma ở Việt Nam.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume
Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [15], Cây cỏ Việt
Nam [10], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu
bí). Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược
như sau:
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Sổ Dilleniidae
Liên bộ Hoa tím Violanae
Bộ Bí Cucurbitales
Họ Bầu bí Cucurbitaceae
Chi Gynostemma.

– 3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [6].
Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài
rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng
hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5.
Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực. Hoa cái có đài và tràng
giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn.
Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín màu đen.
Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình
tim dẹt.
Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [5], [6], [7].
4

Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm
bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [6].
- Phân bố: tại Việt Nam, cây mọc ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng
Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6].
b. Gynostemma longipes C.Y.W
- Đặc điểm thực vật:
Cây dây leo. Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác. Lá kép chân vịt.
Mép lá răng cưa to. Ngọn lá nhọn dài. Mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới
nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa. Lá bên nhỏ dần. Tua
cuốn mảnh, rẽ đôi muộn.
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh. Hoa đực rất
nhỏ, màu trắng. Đài 5 rời, hình tam giác. Tràng 5, hình tam giác, rời. Nhị 5,
chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao; bao phấn 2 ô.
Cụm hoa cái kép 3 lần chùm. Hoa cái, cuống dài 1,8 – 2,0 mm. Đài và
tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 – 3
vòi nhụy mập, rời; núm nhụy chia 2 – 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt.
Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 – 7 mm, cuống quả dài 8 – 15
mm. Hạt hình tim, rộng 3 – 4 mm, màu xám nhạt, 2 mặt có hoa văn dạng cục,

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
24
26
27
23 25
28 29
30

Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam
thuộc nhóm dammaran (hình 1.1). Dammaran là nhóm saponin triterpenic có
cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic). Trong công thức phân tử có 30
carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi. Các saponin

28
29
17
R
3
R
4
O
R
2
R
1

CH
2
OH
OH
OH
OOH
O
OCH
3
CH
2
O
OH
Glu
O
Rha
a

Gynos TN1, Gynos TN2
R3
- CH
3
- CH
2
OH
- CHO
Gypenosid I, Rb1

Gylongiposid I
R4
- OH
- H
= O
Rb1
Gylongiposid I
Gypentonosid A
R5
- OH
- đường đôi; thường là glu kết hợp với
rha hoặc xyl
Rg3, Rf
Rb1, gymnemasid II
R6
- CH
3

- CH
2

OH
28
29
30
12
24
26
27
18

Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được
phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-
epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34].
Các saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino đa số ở dạng bột vô
định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [31], Gynogenin II
[33] và Gynosaponin TN1 [31].
b. Loài Gynostemma longipes C.Y. Wu
Năm 1993, Sun và cộng sự đã phát hiện 2 saponin là Gylongosid A: 18-
Norfurostan-19-al, 23-hydroxy-4,4,8,14,24-pentamethyl-3-[(2-O-β-D-
xylopyranosyl-β-D-xylopyranosyl)oxy]- (3β,16ξ,21β)- (9Cl) và Gylongosid
B: 18-Norfurostan-19-al, 3-[(O-6-deoxy-β-L-mannopyranosyl (1→2)-O-β-D-
xylopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl)oxy]-23-hydroxy-4,4,8,14,24 -
pentamethyl-, (3β,16ξ,21β)- (9Cl) [40]. Năm 1997, Guo và cộng sự đã phân
lập được 3 saponin nhân dammaran trong đó có 1 saponin mới là
Gylongiposid 1: 19-oxo-3β,20(S),21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-L-
rhamnopyranosyl(1-2)][β-D-xylopyranosyl(1-3)]} α-L-arabinopyranoside,
còn 2 chất còn lại là gypenosid XLIX và ginsenosid Rb1 [24].

9

dammaran glycosid mới từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất loài
Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex Oliver. Phần aglycol triterpenoid
có nhóm carbonyl ở cả C21 và C28, lần đầu tiên được tìm thấy trong họ
Cucurbitaceae [48].
1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid
Flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong các loài thuộc
chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu.
- Từ Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đã phát hiện một số
flavonoid là ombuin, ombuoside, rutin [36]
, quercetin-di-(rhamno)-hexosid,
11

quercetin-rhamno-hexosid, kaempferol-rhamno-hexosidvà kaempferol-3-O-
rutinosid [38].
- Năm 2006, Yin và các cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid là rutin,
kaempferol và quercetin từ loài Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex
Oliver [48].
- Một nghiên cứu của các tác giả tại Đại học Y Quảng Tây (Trung Quốc)
so sánh hàm lượng của flavonoid trong 6 loài Gynostemma thu hái tại Quảng
Tây bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 510 nm, so sánh với
chuẩn nội rutin
cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong loài
Gynostemma guangxiense X.X.Chen&D.H.Qin là cao nhất [28].
1.1.2.3. Các chất khác
- Sterol: chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng 0.0001%) bao gồm các loại ergostanol,
sitosterol và stigmasterol [34].
- Nghiên cứu phương pháp xác định chlorophyll và dẫn chất trong G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng HPLC-MS. Đã tách và xác định được
trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino có 15 chlorophyll và dẫn chất:
Pheophytina, pheophytin a’, chlorophyll a, chlorophyll a’, hydroxypheophytin


Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC [38], [37]
Đặc điểm
HPTLC
TLC
Kỹ thuật
Tự động
Thủ công
Kích thước hạt
hấp phụ
5 – 6µm
10 – 12µm
Độ dày bản mỏng
100µm
250µm
Chiều cao đĩa
12µm
30µm
Hiệu quả
Cao do kích thước hạt nhỏ
hơn
Thấp hơn
13

Phân tách ở
3 – 5 cm
10 – 15 cm
Thời gian phân
tích
Khoảng cách di chuyển

bộ sắc ký đồ và máy qu
ét
là hình thức cao
densitometer
Không
Thời gian tách
3 – 20 phút
20 – 200 phút
Giới hạn phát
hiện
( hấp phụ )
100 – 500 pg
1 -5 ng
Giới hạn phát
hiện huỳnh quang
5 – 10 pg
50 – 100 pg
1.3.2. Camag Reprostar 3

14

Hình 1.7. Camag Reprostar 3
Camag reprostar 3, là bộ phận chụp hình ảnh sắc ký đồ, gồm một máy
ảnh đứng và các thiết bị đáp ứng yêu cầu tạo ra một bước sóng ánh sáng phù
hợp.
Các loại bước sóng ánh sáng:
- 254 nm, UV bước sóng ngắn – ánh sáng thường.
- 366nm, UV bước sóng dài – ánh sáng thường.
- Ánh sáng trắng 400 – 750 nm – ánh sáng thường, ánh sáng truyền qua,
ánh sáng thường kết hợp ánh sáng truyền qua.

khiển bằng phần mềm cho phép HPTLC được ứng dụng rộng rãi. Linomat 5.0
là một thiết bị bán tự động có thể thay thế cho thiết bị tự động ATS 4 mà
không ảnh hưởng đến chất lượng của hệ thống. Thiết bị này được dùng trong
phân tích định tính và định lượng, phù hợp với lượng mẫu trung bình. Trái
ngược với ATS 4, việc thay đổi mẫu đối với Linomat 5.0 được thực hiện thủ
công.
Các tính năng chính:
- Hoạt động theo chế độ độc lập hoặc theo winCATS.
- Đưa mẫu thành dải hẹp bằng cách phun kỹ thuật.
- Áp dụng các giải pháp trên sắc ký phẳng.
- Hoạt độngbán tự động, việc thay đổi mẫu (làm sạch, làm đầy và thay
thế ống tiêm) được thực hiện bằng tay [20]. 16

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 4 loài Giảo cổ lam với 16 mẫu khác
nhau bao gồm:
- Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại các địa
phương khác nhau gồm: Tam Đảo (5 mẫu), Đà Lạt (4 mẫu), Đắc Nông (1
mẫu), Hòa Bình (3 mẫu). Trong 5 mẫu Tam Đảo, có 3 mẫu có cách trồng
khác nhau (trồng ngoài nắng, trồng giâm hom trong nhà lưới, trồng xen kẽ với
cây rừng và cây ăn quả), 2 mẫu thu hái tại thời điểm khác nhau (3 tháng, 4
tháng).