BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ THÚY

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH
TỔNG HỢP KHÁNG SINH
NHỜ STREPTOMYCES 183.24

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY
GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH

        

          

                
    

 
    
Sinh viên    MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 2
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 2
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh 2
1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 3
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn 3
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 3
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4
1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 4

2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh 16
2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm 17
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 17
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 17
2.3.3. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 18
2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 19
2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên 20
2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV 20
2.3.7. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 21
2.3.8. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 22
2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22
2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng……… 22
2.3.11. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột và sơ bộ xác định một số tính
chất của kháng sinh thu được 23
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25
3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.24 25
3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 26
3.2.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 26
3.2.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27
3.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28
3.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2…………………………………….29
3.2.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm 30
3.2.6. Kết quả chọn chủng lên men 30
3.2.7. Độ bền với pH, nhiệt 31
3.3. Chiết suất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc 32
3.3.1. Kết quả chọn pH chiết 33
3.3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 34
3.3.3. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh 34
3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 34
3.3.5. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 35

5
DM
Dung môi
6
DMHC
Dung môi hữu cơ
7
ĐB1
Đột biến lần 1
8
ĐB2
Đột biến lần 2
9
Gr(+)
Gram dương
10
Gr(-)
Gram âm
11
ISP

International Streptomyces Project
(Chương trình Streptomyces quốc tế)
12
IR
Investor relations
13
KS
Kháng sinh
14

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Ký hiệu
Nội dung
Trang
1
Bảng 2.1
Các vi khuẩn kiểm định
13
2
Bảng 2.2
Các dung môi đã sử dụng
15
3
Bảng 3.1

Bảng 3.8
Độ bền của kháng sinh với nhiệt
31
11
Bảng 3.9
Độ bền của kháng sinh với pH
31
12
Bảng 3.10
Kết quả chọn pH chiết
32
13
Bảng 3.11
Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký
33
14
Bảng 3.12
Kết quả chạy sắc ký cột lần 1
34
15
Bảng 3.13
Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột
lần 1
35
16
Bảng 3.14
Màu sắc từ phân đoạn 7 đến 14 của sắc ký cột lần 1
35
17
Bảng 3.15

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh ra đời là một bước ngoặt quan trọng của y-dược học. Nhờ đó mà nhân
loại đã chống lại được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, viêm phổi… Hiện
nay, kháng sinh trở thành 1 nhóm thuốc thiết yếu. Với nền khoa học ngày càng phát
triển, nhóm thuốc kháng sinh không chỉ dừng lại ở chỉ định điều trị nhiễm khuẩn,
nhiễm nấm mà còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS với
nhiều kết quả khả quan.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu kháng sinh mới đang có xu hướng giảm dần theo thời
gian do chi phí, nhân lực còn hạn chế. Đó chính là nguyên nhân các hãng dược phẩm
đang có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai nghiên cứu thuốc kháng sinh mới. Trong
khi đó, việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý gây ra tình trạng kháng thuốc ngày càng
nghiêm trọng và xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng chéo với các kháng sinh có
cấu trúc tương tự. Do vậy, đẩy mạnh nghiên cứu kháng sinh mới có hiệu quả điều trị
cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết.
Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn
gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài:
”Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.24” làm khóa
luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau đây:
- Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.24.
- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Xác định các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh, sơ bộ xác định một số
tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được.
2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
Năm 1929 thuật ngữ "c hất kháng sinh" được Alexander Fleming mô tả một cách
đầy đủ và đã mở ra kỷ nguyên mới trong ngành y dược học, khai sinh ra ngành công
nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người

oryzae, Herbicidin A và B là kháng sinh diệt cỏ do S.saganonensis tạo ra, nó kìm
hãm sự phát triển của Xanthomonas oryzae gây bệnh ở lúa…
 Trong công nghiệp thực phẩm: kháng sinh được sử dụng trong công nghiệp
thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp, cho thêm kháng sinh vào nhằm giảm
thời gian khử trùng bằng nhiệt. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo
ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra) [7].
1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới
Một trong các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các
chất kháng VSV. Tuy nhiên, các VSV đã và đang phát triển tính kháng với các kháng
sinh hiện có bằng các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Do vậy, cần phải
có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là
các hợp chất chống khối u và vật ký sinh.
Ngoài ra, cần có các kháng sinh mới cho nông nghiệp để làm thuốc chữa bệnh cho
cây trồng và vật nuôi vì các bệnh đó sẽ ảnh hưởng đến con người thông qua chuỗi thức
ăn [19],[32].
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn
1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật có cấu tạo dạng sợi phân
nhánh, là các vi khuẩn gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có tỷ lệ G+C > 55%. Chúng phân
4

bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong
cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Do có thể sinh tổng hợp được
nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ, các
enzym… nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [8].
Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên
trong tế bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào). Các chủng xạ
khuẩn cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc
các loài khác nhau cũng có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh [8],[43].
Bảng 1 phụ lục giới thiệu một số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng.

một thời gian phát triển, trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử là cơ
quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, phân cắt thành các bào tử trần.
Đặc điểm sinh lý: streptomyces là VSV dị dưỡng và hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát
triển từ 20-40°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. Để phát triển chúng phân giải các
hydratcacbon như tinh bột, glucose làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng,
đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit.
Khả năng tạo sắc tố: được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ
chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt), sắc tố melanoid [8].
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích
Xạ khuẩn thuần chủng phân lập từ tự nhiên thường có HTKS không cao, hiệu suất
sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được kháng sinh có hoạt tính và hiệu suất sinh tổng
hợp cao đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên
cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp [7],[9].
6

1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết,
có cá thể có HTKS tăng mạnh gấp 20-30% so với những cá thể khác. Chọn lấy cá thể
có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [7].
1.3.3. Đột biến cải tạo giống
Để chọn được các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, tiến hành gây
đột biến liên tiếp kết hợp sàng lọc ngẫu nhiên các chủng sống sót [20] và kết hợp các
phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và
dung hợp tế bào trần đã đem lại nhiều kết quả, không những nâng cao hiệu suất sinh
tổng hợp mà còn rút ngắn được thời gian cải tạo giống mới [7].
Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 2 nhóm:
- Tác nhân hóa học: có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, đồng thời gây thay
đổi trạng thái của ADN nên làm thay đổi cấu trúc gen. Một số tác nhân hóa học: acid
nitrơ (HNO

1.4.1. Định nghĩa
Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV
(trong điều kiện yếm khí hay kỵ khí) [20] nhờ sự xúc tác của các enzym với mục đích
cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [7]. Lên men là giai đoạn
nuôi VSV để chúng tạo sản phẩm hoặc là sinh khối VSV, hoặc là các sản phẩm trao
đổi chất bậc 1,2,…[22].
Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể,
là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng
của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào pha cân bằng [6],[7],[15].
Hình P1 phụ lục, trình bày các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn.
1.4.2. Các phương pháp lên men
- Phương pháp lên men bề mặt: môi trường dùng trong phương pháp này ở thể rắn
hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy
không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường. Phương pháp này có nhược điểm là tốn
mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử
dụng phương pháp này trong chọn giống và giữ giống [7].
8

- Phương pháp lên men chìm: vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng, phát triển
cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt,
nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
Có 4 kiểu lên men chìm là: lên men mẻ, lên men bổ sung, lên men liên tục, lên men
bán liên tục [7],[9],[10],[20],[22].
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- Nhiệt độ: là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của VSV và hiệu
quả lên men. Quá trình lên men thường tỏa nhiệt rất lớn nên nhiệt độ trong các thiết bị
lên men thường tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp, vì vậy cần phải giám sát và
điều chỉnh nhệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men [22].
- pH môi trường: có thể các ion H
+

 Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy.
 Có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt hoạt chất ít hòa tan tạp chất.
 Dễ cất thu hồi [7].
- Phương pháp sắc ký: là phương pháp phân tách các chất trong hỗn hợp bằng cách
dùng môi trường động (pha động) đưa hỗn hợp dung môi qua môi trường cố định trên
bề mặt (pha tĩnh). Các chất được tách ra nhờ sự khác biệt của tương tác giữa chúng với
pha tĩnh. Được ứng dụng trong kỹ thuật phân tách, làm giàu, tinh chế, phân tích định
tính, định lượng [5],[16].
 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả
năng bị hấp phụ khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn. Chất hấp phụ
được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di
chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf [5],[16].
 Sắc ký lỏng trên cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố
khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm
phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn (chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi
vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [5].
- Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion hoặc bằng phức chất.
10

1.6. Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
Sau quá trình tách chiết, tinh chế thì việc phân tích phổ của thành phần kháng sinh
tinh khiết thu được nhằm định hướng cấu trúc kháng sinh là khâu then chốt trong
nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh.
1.6.1. Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS)
Nguyên lý: quang phổ tử ngoại xuất hiện là do các electron trong phân tử chuyển
dời từ mức năng lượng của trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích khi chúng hấp
thụ năng lượng trong vùng UV-VIS. Cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu
có mối quan hệ chặt chẽ với quang phổ hấp thụ. Các phân tử có: nối đôi liên hợp, nhân
thơm, các dị tố… có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS [5],[26].
Phổ UV là đồ thị biểu diễn sự hấp thụ năng lượng của tia UV bởi mẫu chất theo độ

dạng các chất), xác định cấu trúc và định lượng các chất.[5]
1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh
Thư viện plasmid của Streptomycetes clavuligerus được xây dựng và sau đó được
chuyển đến Streptomycetes lividans để kiểm tra khả năng sinh kháng sinh, có 12 nhóm
được xác định là có khả năng kích hoạt các cụm gen câm có khả năng sinh tổng hợp.
Quá trình này hỗ trợ việc xác định các chất hoạt hoá sinh tổng hợp kháng sinh.
Sự biểu hiện của các cụm gen chuyển hóa thứ cấp trong Streptomycetes được điều
khiển bởi gen hoạt hóa. Tăng số lượng bản sao làm tăng sản xuất kháng sinh hoặc kích
hoạt các cụm gen câm có khả năng sinh tổng hợp. Đặc tính này đã được sử dụng cho
các nhân bản của abaA, afsQ1/Q2, afsR từ Streptomycetes coelicolor và afsR2 từ
Streptomycetes lividans làm tăng sinh tổng hợp kháng sinh. Tạo ra thư viện gen của S.
clavuligerus ATCC 27064 (NRRL3585) với 2.400 cosmids (kích thước trung bình là
33 kb, tương ứng 10 gen) trong Escherichia coli và sau đó chuyển các bản sao trực
tiếp đến S. lividans để kiểm tra khả năng sinh kháng sinh. Ngoài ra, đưa plasmid
pUZ8002 vào vi khuẩn E. coli XL1-Blue MR để sản xuất dòng XLUZ. pUZ8002 huy
động các oriT-plasmid có hiệu quả từ E. coli. XLUZ như các máy chủ nhân bản để xây
dựng các thư viện gen S. clavuligerus. Sử dụng pJTU2554 tích hợp (attP φC31) cos
12

oriT vector làm vector nhân bản. Các chủng vi khuẩn E. coli có chứa các cosmid
S.clavuligerus được nuôi cấy. Trong 2400 cosmid, tìm thấy 105 cosmid (4%) đã được
kích hoạt bởi các dòng cosmid vô tính. Tất cả 105 cosmid lại được đưa vào S. lividans
bằng tiếp hợp, và xác nhận rằng sản xuất kháng sinh là do cosmids mà không phải do
đột biến tự phát [41].
1.8. Nghiên cứu kháng sinh natamycin sản xuất bởi Streptomyces lydicus (quá
trình lên men, chiết suất, tinh chế và một số tính chất)
Kết quả giải trình tự 16S rADN thu được so sánh với trình tự các Streptomyces, sử
dụng chương trình ”the Tree View program” để so sánh thì kết quả giống Streptomyces
lydicus 99%. Quá trình lên men được thực hiện trong 5 ngày ở 30

: C -O Các tia cực
tím (UV) hấp thụ ở bước sóng λ
max
=212,5; 271,0 và 280nm. Phổ MS: trọng lượng
phân tử là 664,34. Phổ NMR cho thấy các đỉnh OFD = 180 và 165 chứng tỏ có nhóm
carboxyl và ester, đỉnh cao của d = 130: polyethylen [31].
13

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng Streptomyces 183.24 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược
Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại quận 9, thành phố Hồ Chí Minh.
 Chủng VSV kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được trình bày ở
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các vi khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gram (+)
Vi khuẩn Gram (-)
Bacillus cereus ATCC 9946
Escherichia coli ATCC 25922
Bacillus pumilus ATCC 6633
Proteus mirabilis BV 108
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa VM 201
Staphylococcus aureus ATCC 1228
Salmonela typhi DT 220

Shighella flexneri DT 112
 Môi trường
- Các MT nuôi cấy xạ khuẩn: thành phần các MT được trình bày ở phụ lục 1.2.

; 1,0g MgSO
4
.7H
2
O; 1,0g NaCl; 2,0g
(NH
4
)
2
SO
4
; 2,0g CaCO
3
; 1,0g dung dịch muối vi lượng; 20,0g thạch; nước cất vđ
1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: 1,0g L-asparagine; 10,0g glycerin; 1,0g K
2
HPO
4
; 1,0ml dung dịch muối vi
lượng; 20,0g thạch; nước cất vđ 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP6: Dung dịch A gồm: 20,0g pepton; 0,384g acid citric; 0,556g FeSO
4
.7H
2
O;
0,264g NH
4
OH 25%; 10,0ml Na
2

Dung dịch Pridham và Gottlieb (B): 0,64g CuSO
4
.5H
2
O; 0,11g FeSO
4
.7H
2
O; 0,79g
MnCl
2
.4H
2
O; 0,15g ZnSO
4
.7H
2
O; nước cất vđ 1000ml.
ISP9: 2,64g (NH
4
)
2
SO
4
; 2,38g KH
2
PO
4
; 5,65g K
2