BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THANH HÀ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG
CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI
PHỔ (LC-MS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2014

3. Công ty CP Dược Phẩm Mediplantex

HÀ NỘI-2014 HÀ NỘI-2014 LỜI CẢM ƠN
Vi lng knh trng v bit ơn sâu sc tôi xin đưc by t lời cm ơn chân
thnh ti:
ThS. Phùng Minh Dũng, CN.Vũ Tùng Lâm v các thầy cô giáo trong bộ môn
Hóa Phân Tch, những người đã nhiệt tình ging dạy tôi về c lý thuyt v thực hnh,
trực tip cung cấp, góp ý cho tôi những thông tin, kin thức rất hữu ch đ tôi có th
hon thnh đưc khóa luận ny.
TS. Trần Việt Hùng, Phó viện trưởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã
tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong sut quá trình nghiên cứu v th nghiệm thực t trên
cá Nóc.
TS. Bùi Hồng Cường, Ging viên Bộ môn Dưc Cổ Truyền, một người thầy đáng
knh trong công việc cng như trong cuộc sng. Thầy đã định hưng v cho tôi những
lời khuyên bổ ch đ tôi hon thnh khóa luận ny.
Dược sĩ Dương Minh Tân đã trực tip hưng dẫn, ch bo v tạo mi điều kiện
thuận li cho tôi trong quá trình lm việc, nghiên cứu v thu thập s liệu thực t trên
cá Nóc đ tôi có th hon thnh đưc khóa luận.
Xin chân thnh cm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phng đo tạo Trường
Đại hc Dưc H Nội đã tạo mi điều kiện thuận li cho tôi trong quá trình hc tập v
hon thnh khóa luận.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19
2.1.1 Nguyên vật liệu 19
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19
2.2. Nội dung nghiên cứu 21
2.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Chuẩn bị mẫu 21 2.3.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX 23
2.3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng TTX
23
2.3.4. Đánh giá phương pháp. 24
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26
3.1. Chuẩn bị mẫu 27
3.1.1. Mẫu chuẩn 27
3.1.2. Mẫu thử 27
3.2. Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với TTX 28
3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng 29
3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 29
3.4. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS 35
3.5. Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối
phổ LC-MS 41
3.6. Bàn luận 41
3.6.1. Về quy trình chiết tách và xử lý mẫu 41
3.6.2. Về phương pháp phân tích LC/MS 41
3.6.3. Về kết quả định lượng một số mẫu cá Nóc 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
KẾT LUẬN 44
KIẾN NGHỊ 45

LOQ
Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)
MLD
Mean Lethal Dose (Liều gây chết trung bình)
SIM
Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion)
SPE
Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)
SRM
Selected Reaction Monitoring (Chọn lọc ion con sau phản ứng)
TIC
Total Ion Chromatogram (Sắc đồ toàn ion)
TTX, UV
Tetrodotoxin, Ultra Violet (Tia cực tím)
AG, SG
Auxiliary Gas (khí bổ trợ), Sheath Gas (khí thổi)
RSD
Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)
DANH MC CÁC BẢNG

Bảng 3.1
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Tr.35
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Tr.35
Bảng 3.3

Tr.11
Hình 1.6
Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiu ESI
– kt ni phun sương)
Tr.14
Hình 1.7
Kỹ thuật Electrospray Ionization
Tr.16
Hình 2.1
Nội tạng cá Nóc được mổ lấy ra để đem đi xử lí
Tr.19
Hình 2.2
Sơ đồ quy trình xử lí mẫu, chiết và làm giàu
Tr.22
Hình 3.1
Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX
Tr.29
Hình 3.2
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký A
Tr.30
Hình 3.3
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký B
Tr.31
Hình 3.4
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký C
Tr.32
Hình 3.5
Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký D
Tr.33
Hình 3.6

Quốc. Chúng được dùng trong y dược, nghiên cứu khoa học và lĩnh vực khác. Do vậy,
chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình định lượng độc tố
của một số loài cá Nóc biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học (làm thuốc),
trong đó đặc biệt quan tâm đến tetrodotoxin.
Sắc ký lỏng khối phổ hiện đang là phương pháp phổ biến, với nhiều ưu điểm
như độ nhạy cao, chính xác, vì vậy, ứng dụng phương pháp này để định lượng độc tố
TTX với một hàm lượng nhỏ là hết sức phù hợp và cần thiết.
Từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng
Tetrodotoxin trong phủ tạng cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)” với các
mục tiêu:
- Xây dựng phương pháp định lượng Tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ.
- Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng Tetrodotoxin trong phủ tạng cá
Nóc.
2

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 TNG QUAN V C NC V TETRODOTOXIN
1.1.1 Cá nóc [3], [7], [8], [9], [17], [28], [29], [30].
Bộ Cá nóc (tên khoa học là Tetraodontiformes) chứa 10 họ còn sinh tồn với
khoảng 360 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [17]. Phần lớn các loài là cá nước mặn
và sinh sống trong hay xung quanh các bãi đá san hô ngầm vùng nhiệt đới, nhưng có
vài loài là các nước ngọt, sinh sống trong sông suối hay cửa sông.
Các hình dạng kỳ dị được thấy trong bộ cá này: có thể gần như là hình vuông hay tam
giác (các loài cá nóc hòm), hình cầu (các loài cá nóc) cho tới dẹp bên (các loài cá đầu)
[3].
Cá nóc phòng thủ bằng cách hy sinh tốc độ: ở loài này lớp vảy đã biến đổi thành các
tấm hay các gai cứng. Các gai này đôi khi có thể thụt vào và có thể khóa tại chỗ (như ở
các loài cá nóc gai), hay với lớp da dai như da thú (các loài cá đầu và cá bò giấy). Một
đặc điểm phòng ngự đáng chú ý khác được thấy ở các loài cá nóc và cá nóc nhím là
khả năng phình to cơ thể, để tăng các kích thước so với hình dáng thông thường. Nhiều

(epoxymethanooxy)quinazolin-10-olat, có cấu trúc hóa học, công thức phân tử và phân
tử lượng như sau: ( hình ảnh xác định cấu trúc TTX bằng chạy cộng hưởng từ hạt nhân
tại phụ lục)

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử TTX
Công thức phân tử: C
12
H
17
N
3
O
8

Phân tử lượng: 319,3
TTX tinh khiết là bột tinh thể không màu; TTX sẫm màu ở khoảng 220
o
C không kèm
phân hủy [13] Trong phân tử TTX có một vài nhóm hydroxyl thân nước, khiến nó
không tan trong các dung môi hữu cơ. Khung phân tử của TTX tương tự như cấu trúc
lồng của đá, khiến rất khó hydrat hóa, do vậy nó ít tan trong nước. Do trong phân tử có
nhóm guanidin perhydroquinazolin (guanidin có tính kiềm mạnh), nên TTX tan trong
các dung dịch acid trong nước. TTX cũng có cấu trúc nội este, nên dễ bị các dung dịch
acid mạnh phân hủy, do đó cách duy nhất giữ TTX bền vững trong dung dịch là hòa
tan trong acid hữu cơ yếu [24]. Đặc tính C-4 có thể dễ dàng nhìn thấy từ cấu trúc phân
tử của TTX. C-4 là vị trí ortho của nguyên tử nitơ với nhóm OH ở vị trí xích đạo và
nguyên tử H ở vị trí trục. Bởi vậy, các hoạt tính hóa học và sinh học của nhóm
hydroxyl ở C-4 là rất đáng kể. Nếu H
+
có mặt trong dung dịch, nguyên tử ôxy từ nhóm

tetrodotoxin, phân tử H
2
O dễ dàng bị loại bởi tương tác với H
+
, tạo ra một analog của
TTX chứa liên kết ether, được gọi là “4-epi anhydrotetrodotoxin”. Các đặc tính hóa
học của ba phân tử “tetrodotoxin” này khác nhau không đáng kể. Nhưng chúng khác
nhau đáng kể về hoạt tính sinh học. Ví dụ, độc tố của TTX là 4500 đơn vị chuột/mg;
6

của 4-epi TTX là 710 đơn vị chuột/mg và của 4-epi anhydrotetrodoxin chỉ là 92 đơn vị
chuột/mg [22].
Sự quan trọng của nhóm hydroxyl C-4 còn thể hiện ở chỗ: độc tính của nó giảm
đáng kể khi nó được thay thể bằng những nhóm khác, như H, CH
3
hay CH
3
CO Do đó,
về lý thuyết, cần giữ nhóm hydroxyl trong C-4 ở vị trí xích đạo trong quá trình chiết
TTX. Bởi vậy, điều quan trọng là lựa chọn đúng các vật liệu và thiết bị chiết, pH và
nhiệt độ của dung dịch, thời gian chiết. Độc chất chiết từ cá nóc là hỗn hợp của hơn 10
analog, chủ yếu là TTX, (chiếm tới 70% - 80% khối lượng chiết). Ba analog chính
khác là acid tetrodonic, 4-epi TTX và 4-epi anhydrotetrodotoxin. So với TTX, ba chất
này không khác nhiều về đặc tính hóa học, nhưng khác nhau đáng kể về đặc tính sinh
học (độc tố tính) [22].
TTX tác dụng cả lên hệ thần kinh trung ương lẫn thần kinh ngoại vi, với các biểu hiện
sau :
- Tim mạch: Mạch nhanh, huyết áp hạ, rối loạn nhịp tim. [5], [20].
- Hô hấp: Khó thở, do liệt cơ hô hấp và liệt trung khu hô hấp, da và niêm mạc
xanh tím [10], [20].

18
), còn pha động là phân cực. Cơ chế hấp phụ pha đảo là tương tác không phân cực.
Các chất hấp phụ trong pha đảo thường là C
8
, C
18
và một số loại khác.
- Cơ chế trao đổi ion:
Dựa vào sự trao đổi ion của chất tan (mang điện tích) trong các dung môi phân cực hay
không phân cực với chất hấp thụ trao đổi ion Quá trình này phụ thuộc vào độ chọn lọc
của ion hay số lượng ion cạnh tranh ở các vị trí. Nếu là các chất trao đổi ion mạnh thì
8

dùng silica với nhóm sulfonic acid, còn với các chất trao đổi ion yếu thường liên kết
với nhóm –COOH.
Rửa giải các chất cần phân tích trên pha tĩnh có thể tiến hành theo nhiều cách: nếu trao
đổi cation có thể dùng H
+
của các acid mạnh, hoặc dung cation mạnh hơn (ví dụ, rửa
giải Na
+
thì dung dung dịch K
+
), còn rửa giải anion thì dùng OH
-
hoặc các nhóm anion
mạnh hơn.
*Qui trình của SPE [11], [16].
SPE có bốn bước:
- Bước 1: Điều kiện hóa pha rắn. Đơn giản là cho dung môi chạy qua cột để thấm ướt

phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn
tiếp xúc và không đồng tan với nhau. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc
độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các
hạt chất mang hoặc được gắn hóa học với chất mang. Pha động cùng với mẫu phân tích
được bơm qua cột với tốc độ phù hợp tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn tới
sự tách các chất.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là Detector và
được truyền qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc
đưa ra máy in
Quá trình sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion
o Pha tĩnh
Có rất nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc kí lỏng, loại phổ biến
nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica). Các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt
của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol. Tính phân cực của pha tĩnh phụ thuộc
vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết.
10

Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc kí pha
thuận. Ngược lại, pha động phân cực, pha tĩnh không phân cực được gọi là sức kí pha
đảo.
o Pha động
Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của 2, 3, 4 thành phần. Độ phân
cực của dung môi được xác định bằng hệ số P’, P’ càng cao thì dung môi càng phân
cực. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi thành phần
pha động, tỷ lệ của các thành phần dung môi trong hỗn hợp. Kỹ thuật này được gọi là
rửa giải gradient hay chương trình hóa dung môi.

Hình 1.4. Cấu tạo hệ thng sc ký lng hiệu năng cao
 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass
spectrometry)

Trong phân tích dược phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp LC-MS
cho:
- Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi
- Phân tích thuốc trong dịch sinh học
- Phân tích các hợp chất tự nhiên trong cây thuốc
12

-Trường hợp không sử dụng được các detector khác: Không phát hiện được
bằng detector khác hoặc trong phân tích khẳng định
- Nét nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy, độ đặc hiệu
cao. Giới hạn phát hiện có thể đến 10
-14
gam. Do vậy thường dùng kỹ thuật này để
phân tích hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phần phức tạp.
1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ [1], [2], [4], [6], [12], [19], [26].
a. Pha động
Pha động trong sắc ký lỏng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách.
Pha động thường là hai dung môi (hữu cơ hoặc dung dịch nước) hoà tan vào nhau để
có khả năng tách với độ phân giải phù hợp.
Có hai cách dùng pha động để rửa giải:
 Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình sắc ký.
 Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 đến 4 loại
được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc
ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi).
b. Hệ thống bơm
Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi qua
hệ thống sắc ký. Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:
 Phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách, dòng không liên tục
sẽ gây nhiễu đường nền.
 Không có xung ở áp suất cao

- Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp
thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định
lượng các chất.


Nhiệm vụ của detector khi phổ
- Trong phân tích định tính: Khi ghép với thiết bị sắc ký lỏng, chất phân tích
được xác nhận bằng:
+ Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định t
R
đặc trưng cho chất phân tích
14

+ Phổ khối tương ứng của hoá chất phân tích hoặc phổ khối biểu diễn cường độ
các ion sinh ra từ một ion xác định của chất phân tích.
Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là
chỉ dựa vào thời gian lưu.
- Trong phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho định
lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao.

Các bộ phận của detector khi phổ [1], [4], [12], [19], [26].
- Bộ phận np mẫu: Đưa mẫu vào máy. Trong máy sắc ký lỏng khối phổ, bộ
nạp mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng được kết nối với khối phổ. Với LC/MS, đầu ra
của LC là dòng dung môi pha động nếu đưa trực tiếp và toàn bộ dòng dung môi vào
khối phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hành của thiết bị.
Mặt khác, khi đó các ion có trong thành phần dòng dung môi dễ dàng va chạm với các
phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển, và bị bơm chân không của
khối phổ kế hút thải ra ngoài. Do vậy, quá trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải có
các giao diện ghép nối phù hợp (đai chuyển, chia dòng, phun sương,…). Một ghép nối

- K thuật bn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment)
- K thuật phn hấp thụ v ion hoá bằng tia laser
- K thuật ion hóa phun sương điện (Electron Spray Ionization)
- K thuật ion hóa hóa hc  áp suất kh quyn (APCI)
- Kĩ thuật ion hóa ánh sáng  áp suất kh quyn (APPI)
Hiện nay chủ yếu sử dụng hai kỹ thuật phun điện tử (ESI) và ion hoá bằng hoá học ở
áp suất thường (APCI) hoặc kết hợp 2 kỹ thuật này.
Kỹ thuật sử dụng trong khoá luận này là kỹ thuật ESI [18], kỹ thuật được sử dụng phổ
biến nhất trong LC-MS. Kỹ thuật này được mô tả như sau:
16 Hình 1.7. K thuật Electrospray Ionization
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền
nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa
điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa
êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide,
nucleotide Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và
sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại
bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi
giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này
tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia
thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này
được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang
điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện
sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải
được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điều này phụ
thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer):
Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được

Trích đoạn Nguyên vật liệu, thiết bị Về phương pháp phân tích LC/MS

---