BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH
METRONIDAZOL TRONG NƯỚC THẢI TẠI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN HÀ NỘI BẰNG KỸ
THUẬT SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC – MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn gia đình,người thân,bạn bè đã luôn khích
lệ,chia sẻ,động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5/2013
Sinh viên

Trần Thị Lan
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1.TỔNG QUAN VỀ METRONIDAZOL 3
1.1.1. Công thức cấu tạo 3
1.1.2. Tính chất lý hóa 3
1.1.3. Đặc điểm dược động học 3
1.1.4. Dược lý – dược lâm sàng 4
1.1.5. Chế phẩm chứa metronidazol trên thị trường 5

3.3.7. Khảo sát độ ổn định 37
3.3.7.1. Độ ổn định trong dung môi 37
3.3.7.2. Độ ổn định trong dung dịch thử 39
3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MTD TRONG NƯỚC THẢI BỆNH VIỆN 40
3.5. BÀN LUẬN 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APCI : Atmospheric pressure chemical ionization
( Ion hóa hóa học ở áp suất thường )
BOD : Biochemical Oxygen Demand
( Nhu cầu oxy sinh hóa )
COD : Chemical Oxygen Demand

Bảng 3.2: Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn MTD trong nước thải 22
Bảng 3.3: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước ( QC-W) 23
Bảng 3.4: Chuẩn bị các mẫu QC trong nước thải 23
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 27
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát tốc độ dòng 27
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng chiết của các phương pháp 31
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 32
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của MTD 34
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 36
Bảng 3.12: Kết quả độ ổn định của MTD trong dung môi 38
Bảng 3.13: Kết quả độ ổn định của MTD trong nước thải 39
Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu nước thải bệnh viện 40
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô hình hệ thống LC/MS 10

gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và nguy hại đến đời sống con người. Điều
quan tâm hàng đầu đối với nước thải của các bệnh viện là vấn đề các vi trùng gây
bệnh và thuốc kháng sinh
.
Các sinh vật được tiếp xúc lâu dài với các chất kháng
sinh ở nồng độ thấp trong môi trường sẽ kích thích sự phát triển của các chủng vi
khuẩn kháng thuốc và duy trì quần thể các chủng kháng thuốc. Hiện tượng kháng
kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người, đang
là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn kháng kháng sinh làm giới hạn
khả năng điều trị nhiễm trùng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh
nhưng kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi
khuẩn gây bệnh khác. Nhưng tình trạng xử lý nước thải bệnh viện hiện nay lại
chưagiám sát được dư lượng thuốc kháng sinh, chưa được đưa vào tiêu chuẩn quản
lý.
Metronidazol là một dẫn chất thuộc nhóm 5- nitro imidazol, có phổ hoạt tính
rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí. Nên
metronidazol có một vị trí rất quan trọng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn,
đặc biệt là vi khuẩn kỵ khí. Vì vậy, việc định lượng hàm lượng kháng sinh
metronidazol trong nước thải tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hà Nội là
rất cần thiết nhằm xác định được tình hình thực trạng dư lượng kháng sinh trong
nguồn nước thải và đề xuất những giải pháp quản lý, xử lý phù hợp nhằm đem lại
hiệu quả cao và tránh được tình trạng kháng kháng sinh.
Hệ thống phân tích LC/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuật phân tích, tạo điều
kiện cho các nhà khoa học thực hiện được các nghiên cứu phức tạp. Với ưu điểm
vượt trội về độ nhạy và tính đặc hiệu, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp
dụng nhiều trong nghiên cứu các chất có hàm lượng thấp.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp
định lượng và khảo sát hàm lượng kháng sinh metronidazol trong nước thải
một số bệnh viện Hà Nội bằng kỹ thuật LC- MS”.
Với các mục tiêu: 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH METRONIDAZOL
1.1.1. Công thức cấu
tạo[4], [5], [26], [33].
• Công thức phân tử: C
6
H
9
N
3
O
3

• Khối lượng phân tử: M = 171,2 g/mol.
• Tên khoa học: 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)ethan-1-ol
1.1.2. Tính chất lý hóa [4], [27], [28].

1.1.4.1. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Metronidazol là một dẫn chất 5 - nitro - imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động
vật nguyên sinh như amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí.
• Metronidazol là một thuốc rất mạnh trong điều trị nhiễm động vật nguyên sinh
như Entamoeba histolytica, Giardia lambliavà Trichomonas
vaginalis.Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn
trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng
không có tác dụng trên vi khuẩn ái khí.
• Có tác dụng diệt vi khuẩn Campylobacter/ Helicobacter pylori gây bệnh viêm dạ
dày mạn tính và loét dạ dày tá tràng.
• Cơ chế: Trong ký sinh trùng, nhóm 5 - nitro của thuốc bị khử thành các chất trung
gian độc với tế bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm
vỡ các sợi này và cuối cùng làm tế bào chết. Nồng độ trung bình có hiệu quả của
metronidazol là 8 µg/mL hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh
và các vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ tối thiểu ức chế (MIC) các chủng nhạy cảm
khoảng 0,5 µg/mL.
• Kháng thuốc: Metronidazol chỉ bị kháng trong một số ít trường hợp, thường gặp
ở một vài chủng Trichomonas vaginalis, hiếm khi gặp với Bacteroides và những
vi khuẩn kỵ khí khác . Các chủng kháng Metronidazol đã được chứng minh chứa
ít ferrdoxin, chất này là một protein xúc tác khử hóa metronidazol. Trong các
chủng đó, ferredoxin giảm nhưng không mất hoàn toàn, có lẽ giải thích tại sao
nhiễm khuẩn với các chủng kháng đó lại đáp ứng với liều metronidazol cao và
kéo dài hơn.
5
1.1.4.2. Chỉ định
- Ðiều trị các trường hợp nhiễm Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica (thể
cấp tính ở ruột và thể áp xe gan), Dientamoeba fragilis ở trẻ em, Giardia lamblia


1.1.6. Một số phương pháp định lượng Metronidazol đã được tiến hành.
1.1.6.1. Định lượng metronidazol bằng đo acid trong môi trường khan:
• Chỉ thị đo thế: [4], [5], [23], [28].
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol trong acid acetic khan, chuẩn độ bằng
HClO
4
0,1 N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo thế. 1mL
dung dịch acid HClO
4
0,1 N tương đương với 17,12 mg C
6
H
9
N
3
O
3
.
• Chỉ thị màu: [1], [29], [30], [31], [32], [33].
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng anhydrid acetic, đun nóng nhẹ để
hòa tan chất tan, làm lạnh và thêm một giọt thuốc thử xanh malachite TS ( hoặc chỉ
thị là p- naphtholbenzein chuẩn). Định lượng bằng acid HClO
4
0,1 N, kết thúc định
lượng khi dung dịch chuyển màu vàng xanh đối với malachit (chuyển từ vàng xanh
sang xanh lá cây đối với chị thị naphtholbenzein). 1mL HClO
4
ứng với 17,12 mg
C

- Cột Supelco IC-AB2 C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm).
- Detector UV đặt ở 292 nm.
- Pha động: acid phosphoric 0,01 M : CH
3
CN : CH
3
OH ( 1000 : 225 : 25 ).
Metronidazol có tính base, nên dùng pha động pH = 2,4 ( <3) có lợi hơn dùng pH
trung hòa. Metronidazol rất dễ tan trong acid, bề rộng của pic sẽ hẹp và tính đối
xứng được đảm bảo (hệ số cân đối 0,9- 1,1).
1.2. Giới thiệu chung về thực trạng nước thải ở các bệnh viện tại Hà Nội [37],
[38].
1.2.1. Thành phần, tính chất nước thải bệnh viện
Thành phần chính gây ô nhiễm môi trường do nước thải bệnh viện gây ra là:
- Các chất hữu cơ: BOD, COD.
- Các chất rắn lơ lửng .
- Các vi trùng, vi khuẩn gây bệnh: Salmonella, tụ cầu, liên cầu, virus đường tiêu
hóa, bại liệt, các loại kí sinh trùng, amip, nấm…
- Các mầm bệnh sinh học khác trong máu, mủ, dịch, đờm, phân của người
bệnh.
- Các loại hóa chất độc hại từ cơ thể và chế phẩm điều trị, thậm chí cả chất phóng
xạ.
5
Sunfua (tính theo H
2
S)
mg/L
1,0
4,0
6
Amoni (tính theo N)
mg/L
5
10
7
Nitrat (tính theo N)
mg/L
30
50
8
Phosphat (tính theo P)
mg/L
6
10
9
Dầu mỡ động thực vật
mg/L
10
20
10
Tổng hoạt độ phóng xạ α
Bq/L

- Cột B quy định giá trị tối đa cho phép trong nước thải y tế khi thải vào các nguồn
nước không dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt.
- Trường hợp nước thải y tế dẫn đến hệ thống xử lý nước thải tập trung thì áp dụng
theo
quy định của đơn vị quản lý, vận hành hệ thống xử lý nước thải tập trung.
9

1.2.2. Mức độ xử lý và tình trạng nước thải hiện nay tại các bệnh viện[37],
[38].
Trong bối cảnh quản lý, xử lý nước thải gần như bị thả lỏng, đáng chú ý hơn cả là,
từ trước đến nay, ngành y tế chưa kiểm soát kháng sinh trong nước thải bệnh viện.
Từ năm 2009, Viện Y học Lao động & Vệ sinh Môi trường cùng với một số đơn vị
như Viện Pasteur Nha Trang, Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, Viện Vệ sinh Lao
động TP.HCM thực hiện chương trình quan trắc của Bộ Y tế, trong đó có quan trắc
nước thải bệnh viện. Kết quả quan trắc cho thấy, nước thải bệnh viện có đặc điểm ô
nhiễm chủ yếu như nước thải sinh hoạt chứa vi khuẩn,trong đó có vi sinh vật gây
bệnh đường ruột vốn dễ dàng lây truyền qua nước. Một số chất độc tế bào hay dư
lượng thuốc kháng sinh cũng có khả năng có trong nước thải bệnh viện. Tuy nhiên,
đến nay vẫn chưa xác định được hai thành phần độc hại nói trên. Nguyên do là các
cơ quan này không có phòng thí nghiệm đủ điều kiện phân tích.
Thống kê của Bộ Y tế mới đây cho thấy 67,7% số bệnh viện tuyến trung ương,
56,1% bệnh viện tuyến tỉnh và 44,4% bệnh viện tuyến huyện thực hiện thu gom và
xử lý nước thải theo quy định. Như vậy vẫn còn rất nhiều cơ sở y tế xả chất thải
lỏng ra môi trường.
1.3 . TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT LC/MS [1], [2], [8],[11], [13], [14], [20],
[21], [22], [24], [34]
1.3.1. Khái niệm
Sắc kí lỏng khối phổ là kĩ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các
chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc kí lỏng hiệu năng cao ( High performance
liquid chromatography-HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận

- Ðặc diểm và yêu cầu của một hệ thống bơm cao áp:
Đáp ứng
tín hiệu

Hệ
thống
bơm
Detector
MS
11

• Áp suất có thể đạt đến 1000 bar (15.000 Psi)
• Có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0,01 – 10 mL/min
• Thể tích chết nhỏ
• Trơ với dung môi của pha động
• Có thể trộn 2 hay nhiều dung môi với nhau
 Hệ tiêm mẫu
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà
không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng chứa mẫu có
dung tích khác nhau, thường dùng loại 0,5-20µL.
 Buồng cột
Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích.
 Cột sắc ký
Là một loại cột đặc biệt được nhồi đầy bằng các hạt nhồi (pha tĩnh), kích thước cột:
Dài (L): 10-30cm, đường kính trong: 4-10mm, kích cỡ hạt: 5-10µm. Thông thường
chất nhồi trong cột là Silicagel hoặc Silicagel đã được silan hóa, hoặc được bao một
lớp mỏng hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các hạt khác như nhôm oxyd, polyme
xốp, chất trao đổi ion
 Detector khối phổ
Là bộ phận phát hiện và đo các tín hiệu sinh ra khi có chất ra khỏi cột, các tín hiệu
Hình 1.2:Các bộ phận của detector khối phổ
 Bộ nạp mẫu:
Là đầu ra của máy sắc ký lỏng, kết nối với khối phổ.
 Bộ nguồn ion hóa:
Là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: ion hóa chất cần phân tích, khử dung môi
để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển
với bộ phận nằm trong chân không sâu và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion
khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo.
Có rất nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hiện nay thường sử dụng hai kỹ
thuật là kỹ thuật ion hóa phun điện tử ( ESI) và ion hóa bằng hóa học ở áp suất
thường
(APCI) . Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI.

- Kỹ thuật phun ion ESI ( Electrospray ionization) :
Xử lý dữliệu
Bơm chân không

Hệ chân không áp suất 10
-3
– 10
-6
Pa
Nạp mẫu
Nguồn ion
Phân tích khối

• Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser–ICR)
Thiết bị mà chúng tôi sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực
(quadrupole mass spectrometer). Khối phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt
song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ:

Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực đơn
Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC. Chúng làm cho
các phân tử chuyển động quanh trục trung tâm. Do đó chỉ các ion nhất định mới tới
được detector, sự thay đổi tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác
nhau lần lượt tới detector.
Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : Không nghiên cứu được cơ
chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc
hoá học, do kỹ thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ
thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ
nhạy, độ chính xác.
Máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS/MS gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc
lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ).
MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion mẹ ( precursor ion ), ion này
liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những
ion con ( product ion ), tiếp theo MS thứ hai (tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion
này. Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu.
15 Hình 1.5: Nguyên lý hoạt động của khối phổ 2 lần MS/MS
 Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu:
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm
kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết
xuất dữ liệu thô vừa thu được.
1.3.3. Một số kỹ thuật LC/MS:
17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1.1. Hóa chất