ii
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


PHẠM PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
ACID P-COUMARIC TRONG THÂN CÂY Ý DĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHẠM PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
ACID P-COUMARIC TRONG THÂN CÂY Ý DĨ

xuyên động viên và tạo điều kiện cho em trong thời gian qua. Em xin chân
thành cám ơn các quý vị đại biểu và các bạn đã đến tham dự buổi bảo vệ.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014.
Sinh viên
Phạm Phương Thảo
MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về cây Ý dĩ 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2
1.1.3. Bộ phận dùng, chế biến, công dụng theo y học cổ truyền 4
1.1.4.Thành phần hóa học của cây Ý dĩ 4
1.1.5. Tác dụng dược lí 6
1.2. Tổng quan về acid p-coumaric 7

PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A
S
: Hệ số đối xứng pic
CE-MS: Capillary Electrophoresis with Mass Spectrometry
COD: Calci oxalat dihydrat
COM: Calci oxalat monohydrat
DAD: Detector mảng Diod (Diode-Array Detector)
ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry
EtOAc: Ethyl acetat
HPLC:Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)
MeOH: Methanol
MS: Mass Spectroscopy
R

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi…………… ………………………
Bảng 3.12: Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ……
Bảng 3.13: Hàm lượng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric trong các mẫu
Ý dĩ……………………………………………………………………………. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid acid p-coumaric………………………
Hình 2.1: Cây Ý dĩ……………………………………………………………
Hình 3.1: Sắc kí đồ hệ dung môi 1……………………………………………
Hình 3.2: Sắc kí đồ hệ dung môi 2……………………………………………
Hình 3.3: Sắc kí đồ chương trình dung môi 1…………………………………
Hình 3.4: Sắc kí đồ chương trình dung môi 2…………………………………
Hình 3.5: Sắc kí đồ của hệ acid 1……………………………………………
Hình 3.6: Sắc kí đồ của hệ acid 2……………………………………………
Hình 3.7: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 3 và mẫu acid p-coumaric đối
chiếu…………………………………………………………………………
Hình 3.8: Đường chuẩn và phương trình hồi quy acid p-coumaric……………
Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 1,2,3 và mẫu acid p-coumaric
đối chiếu………………………………………………………………………

2 Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Ý dĩ
1.1.1. Vị trí phân loại
Cây Ý dĩ thuộc chi Coix L., họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân
lớp Thài Lài (Commelinidae), lớp Hành ( Liliopsida), ngành Ngọc Lan (
Magnoliophyta) [5].
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Ý dĩ là một loại cây thảo sống hàng năm, cao chừng 1- 1,5 m.Thân nhẵn
bóng có vạch dọc.Thân có phân nhánh, các mấu phía dưới có thể mọc rễ phụ,
cây mọc thành bụi. Lá hình mác dài 10- 40 cm, rộng 1,5- 3 cm, gân dọc nổi
rõ, gân giữa to. Hoa đơn tính cùng gốc mọc ở kẽ lá thành bông, hoa đực mọc
phía trên, hoa cái phía dưới. Hoa đực có 3 nhị. Quả có mày cứng bao bọc
[1],[4].
Ý dĩ mọc tự nhiên phân bố rải rác ở một số tỉnh miền núi phía bắc như
Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu…Cây thường mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe
suối ở cửa rừng hay trong thung lũng. Ý dĩ trồng thường không cố định theo
khu vực. Vào đầu những năm 90, cây được trồng nhiều ở Kon Tum, Đồng
Nai…Từ năm 1995-1997 ở Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu) và Hà
Tây…Việt Nam là nước trồng nhiều Ý dĩ trong khu vực trong những năm 80
và 90. Ý dĩ của Việt Nam thường xuyên được xuất ra thị trường thế giới
[10],[12].
Ở Việt Nam xác định Ý dĩ có 4 thứ sau [5],[8] :
- Coix lachryma – jobi L.var. lachryma –jobi L: Cườm gạo
Cây cỏ, thân có đường kính 8-10 mm. Lá phẳng, cuống dài 40-50 cm,

đực màu xanh. Bông chét đực mọc chụm 3 chiếc một chỗ trên cùng cuống
chung mảnh. Quả cứng màu vàng hay nâu.
4 1.1.3. Bộ phận dùng, chế biến, công dụng theo y học cổ truyền
- Hạt: hình trứng dài 5-8 mm đường kính 2-5 mm, mặt ngoài màu trắng đục
đôi khi còn sót lại màng vỏ chưa loại hết, mặt trong có rãnh hình máng. Chất
cứng, không mùi, vị ngọt hơi thơm và chứa nhiều tinh bột.Thu hoạch từ tháng
12 đến tháng 1. Cắt về đập lấy quả (thường gọi là hạt) đem phơi khô, loại bỏ
quả lép rồi xay xát lấy hạt [1].
Theo Y học cổ truyền hạt Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn quy vào 5
kinh tỳ, vị, phế, can, đại tràng với công năng chủ trị sau:
+ Lợi thủy: dùng để trị các bệnh phù thũng, tiểu tiện khó, đái buốt.
+Kiện tỳ hóa thấp: dùng để trị bệnh tỳ hư, tiêu hóa kém, tiết tả (hạt sao vàng).
+Trừ phong thấp: dùng để trị đau nhức xương khớp.
+Giải độc tiêu viêm: dùng trong viêm ruột thừa, trứng cá, mụn nhọt.
Liều dùng từ 20-50g [2].
- Rễ: dùng để chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp,
đau xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, bế kinh [5], [12].
- Lá, thân: ít được sử dụng [1].
1.1.4.Thành phần hóa học của cây Ý dĩ
1.1.4.1. Các nghiên cứu nước ngoài
Các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào thành phần hóa học của hạt Ý dĩ.
Bên cạnh tinh bột, đã tìm thấy trong hạt Ý dĩ một số thành phần sau:
- Coixenolid :
Tymosin Ukita và cộng sự [46] đã tách chiết được coixenolid từ dịch
chiết aceton của hạt Ý dĩ (Coix lachryma – jobi L.var. mayuen). Bột nhân hạt
Ý dĩ được chiết với aceton ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem phân lập và tinh chế
bằng sắc kí cột silicagel thu được hợp chất có công thức: C

oleic và acid linoleic.
- Các hợp chất lactam :
Ming-Yi Lee và cộng sự [32] đã tìm ra 5 hợp chất lactam có tác dụng ức
chế tế bào ung thư từ dịch chiết methanol hạt Ý dĩ: coixspirolactam A,
coixspirolactam B, coixspirolactam C, coix lactam và methyl dioxindole-3-
acetat.
-Một số hợp chất khác được phân lập từ hạt Ý dĩ [25] :
eriodictyol, các ceramid (2S, 3S, 4R)-2-[(20R-20-
hydroxytetracosanoyl-amino]-1,3,4- octadecanetriol và acid p-coumaric.
Từ rễ cây Ý dĩ cũng đã phân lập được một số thành phần sau:
- Benzoxazinon :
Otsuka và cộng sự [39] đã phân lập được coixol và 5 hợp chất
benzoxazinon từ phân đoạn chlorofom của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ
(Coix lachryma-jobi L.var. ma-yuen) bao gồm: 2-hydroxy-7-methoxy-
1,4(2H)- benzoxain-3-one; 2-O-β-D- glucopyranoside; 2-O-β-glucopyranosyl-
4-hydroxy-7-methoxy-1,4(2H)- benzoxazin-3-one; 2-O-β- glucopyranosyl-
6 4,7-dimethoxy-1,4 (2H)- benzoxazin-3-one và 2-O-β- glucopyranosyl-7-
hydroxy-1,4 (2H)- benzoxazin-3-one.
- Các hợp chất phenolic và adenosin :
Otsuka và cộng sự [38] đã phân lập được 4 hợp chất phenolic và
adenosin từ phân đoạn chloroform của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ: 4-
ketopinoresinol; threo và erythro-1-C-syringylglycerol; 2,6-dimetoxy-p-
hydroquinone 1-O-β-d-glucopyranoside.
1.1.4.2. Các nghiên cứu trong nước
Gần đây nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã phân lập và xác định được
cấu trúc của 7 chất trong đó:
+ Sáu chất được phân lập từ phân đoạn dịch chiết chloroform thân cây Ý

pháp được mô tả bởi Gohel và Wong [20]. Tác dụng ức chế này tăng dần theo
nồng độ, đồng thời khi có mặt dịch chiết Ý dĩ các tinh thể calci oxalat chuyển
từ dạng COM sang dạng COD là dạng dễ đào thải hơn [13].
+ Tác dụng in vivo: dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể hiện tác dụng ức chế
tinh thể calci oxalat in vivo, làm giảm rõ rệt các đám sỏi lắng đọng tại thận so
với lô chứng bệnh trên chuột cống trắng với mô hình gây sỏi thực nghiệm
bằng ethylen glycol [13].
1.2. Tổng quan về acid p-coumaric
1.2.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của acid acid p-coumaric
8 -Công thức phân tử: C
9
H
8
O
3

-Khối lượng phân tử: 164,16 g.mol
-1

-Tên khoa học: (E)- 3- (4-hydroxyphenyl)- 2- propenoic acid.
1.2.2. Tính chất hóa lý
Acid p-coumaric là một acid hydroxyl cinnamic, là hợp chất hữu cơ mà
nhóm OH được gắn vào acid cinnamic.
Acid coumaric có 3 đồng phân: acid o-coumaric, acid m-coumaric và
acid p-coumaric, khác nhau ở vị trí gắn nhóm OH vào acid cinnamic. Trong

cây Ý dĩ có tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu mạnh nhất. Ở nồng độ ≥ 1
mM, acid p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế hình thành sỏi rõ rệt, tác dụng
này tăng dần theo nồng độ. Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0% ở nồng
độ 10 mM. Tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của acid p-
coumaric mạnh hơn chứng dương natri citrat, với giá trị IC
50
là 2,35 mM
(khoảng tin cậy 95%: 1,47-3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29-
11,16) của natri citrat [13]. Như vậy acid p-coumaric là một thành phần có tác
dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat trong thân cây Ý dĩ . 10 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Nguyên liệu là thân cây Ý Dĩ, được thu hái tại 2 địa điểm là Từ Liêm,
Hà Nội và Phú Lương, Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2013. Dược liệu được
sấy khô, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon buộc kín để nơi khô ráo. Mẫu dược

Thân M1
Coix lachryma – jobi L
.var. lachryma –jobi L
2
Phú Lương-
Thái Nguyên

11/2013

Thân M2
Coix lachryma – jobi L
.var. mayuen Stapf
3
Từ Liêm-
Hà Nội

11/2013

Thân M3
Coix lachryma – jobi L
.var. lachryma –jobi L

2.1.2. Hoá chất và dung môi
- Chất chuẩn: acid p-coumaric của hãng Sigma- Aldrich với hàm lượng
99,6%.
- Methanol, nước cất, acid phosphoric, acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết
dùng cho HPLC.
- Dung môi: methanol, ethyl acetat, toluen, acid formic… dùng cho chiết xuất
và sắc kí đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu

18
(250mm x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với
acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo
sát chương trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải
gradient (gradient elution).
Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về
thời gian lưu (t
R
) của chất phân tích, độ phân giải (R
S
) và hệ số đối xứng pic
(A
S
). Phương pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho R
S
≥ 1,5;
13 A
S
nằm trong khoảng từ 0,8-1,5. Thời gian lưu (t
R
) của các chất phân tích
không quá lớn nhưng phải đảm bảo tách xa nhau [3],[6].
2.3.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành
thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:
 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

nghiệm cá thể khi phương pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một
mẫu. Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính độ
lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD ≤ 2% [6].
 Tỷ lệ thu hồi
Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích sau
quá trình chiết tách xử lí mẫu.
Thêm vào mẫu Ý dĩ 3 đã được xác định hàm lượng acid p-coumaric một
lượng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong
khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng tỷ lệ của chất
chuẩn đối chiếu thu được từ kết quả định lượng so với lượng chất chuẩn thêm
vào ban đầu. Tiến hành định lượng 2 lần đối với mỗi mẫu chiết, chiết lặp lại 3
lần riêng biệt.
2.3.2. Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng
acid p-coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ
Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng acid p-coumaric
trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy kết quả trung
bình. 15 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric
trong thân cây Ý dĩ bằng phương pháp HPLC
3.1.1. Khảo sát quá trình xử lí mẫu
Dựa vào độ tan của acid p-coumaric, tiến hành khảo sát quá trình chiết

mg/ml.
Chương trình sắc kí lỏng được khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện
sắc kí đã được khai triển bởi Geetha và cộng sự [19]:
Cột tách : cột Ascentis C
18
(250mm x 4,6 mm; 5µm)
Tốc độ dòng: v = 0,5 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu : V = 10µl
Detector : UV-VIS ở bước sóng λ = 326 nm
Nhiệt độ cột : t = 35
o
C
Mẫu phân tích: mẫu thử (được chuẩn bị theo quy trình đã được mô tả trong
phần 3.1.1)
3.1.2.1. Khảo sát thành phần dung môi pha động
Thử nghiệm được tiến hành với 2 hệ dung môi sau:
- Hệ dung môi 1: MeOH- acid formic 1% (5:5)
- Hệ dung môi 2: MeOH- acid formic 1% (6:4)
Kết quả sắc kí đồ HPLC với các hệ dung môi 1 và 2 được trình bày ở
hình 3.1 và 3.2 :
17
Hình 3.1: Sắc kí đồ hệ dung môi 1 Hình 3.2: Sắc kí đồ hệ dung môi 2
Các thông số đo được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2
Hệ dung môi t
R
(phút) A