BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ NGÂN BÌNH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ NGÂN BÌNH
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, các phòng ban,
bộ môn và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại
trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ và tạo động lực cho em trong suố t quá trình học tập và thực hiện đề
tài.
Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2015
Sinh viên Vũ Ngân Bình
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Phân tích đồng phân đối quang 2
1.1.1. Đồng phân đối quang 2
1.1.2. Phân tích đồng phân đối quang 4
1.2. Tổng quan về atenolol 9
1.3. Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị 14
3.3.6. Ứng dụng phương pháp định lượng hai đồng phân đối quang
atenolol trong chế phẩm 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AGP
Acid α1-glycoprotein
BGE (Background Electrolyte)
Dung dịch điện ly nền
β-CD
Beta cyclodextrin
CD
cyclodextrin
CE (Capillary Electrophoresis)
Điện di mao quản
CM-β-CD
Carboxymethyl beta
cyclodextrin
EOF (Electroosmotic flow)
Dòng điện thẩm
GC (Gas Chromatography)
Sắc ký khí
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Số bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang Atenolol
bằng HPLC
10
1.2
Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol bằng
CE
11
3.1
Xác định hàm lượng các đồng phân trong chuẩn (R,S)-
atenolol
29
3.2
Độ phù hợp hệ thống
30
3.3
Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của (R,S)-
atenolol và (R)-, (S)-atenolol
32
3.4
Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol
9
3.1
Điện di đồ của dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi sử dụng
mao quản dài 48,5 cm
21
3.2
Điện di đồ khi sử dụng các dung dịch điện ly nền khác nhau a)
Đệm phosphate 50 mM b)Đệm 50 mM Tris – H
3
PO
4
22
3.3
Điện di đồ dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol ở 4 điện thế
a) 15 kV; b) 20 kV; c) 25 kV; d) 30 kV
24
3.4
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của thời gian di chuyển các
đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử
dụng
25
3.5
Điện di đồ dung dịch (R,S)-atenolol 100 ppm khi thay đổi
nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang a) CM-β-CD 6 mM; b)
CM-β-CD 8 mM; c) CM-β-CD 10 mM
26
3.6
Điện di đồ dung dịch a) chuẩn (S)-atenolol và b) chuẩn (R,S)-
Hiện nay, kỹ thuật điện di mao quản được dùng phổ biến để tách các đồng phân
quang học do tính linh hoạt, hiệu lực tách cao, lượng mẫu sử dụ ng ít. Tuy nhiên
ở Việt Nam kỹ thuật này vẫn còn được áp dụng khá hạn chế.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng
phân đối quang atenolol bằng điện di mao quả n” với hai mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của
atenolol bằng điện di mao quản.
2. Ứng dụng phương pháp này định lượng các đồng phân đối quang của
atenolol trong chế phẩm. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Phân tích đồng phân đối quang
1.1.1 Đồng phân đối quang
Đồng phân đối quang là một đồng phân lập thể được hình thành do sự sắp xếp
không gian đối nghịch nhau của các nhóm thế trên một nguyên tử bất đối,
thường gặp nhất là nguyên tử carbon. Hầu hết các tính chất lý hoá của hai đồng
phân đối quang tư ơng tự nhau, trừ khả năng làm quay mặt phẳng ánh sánh phân
cực theo hai góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau.
Đồng phân đối quang làm quay mặt phẳng ánh sang phân cực theo chiều cùng
chiều với kim đồng hồ được gọi là đồng phân (+) hoặc d (tiếng Latin dextro),
đồng phân đối quang là quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều ngược
chiều với kim đồng hồ đư ợc gọi là đồng phân (-) hoặc l (tiếng Latin là levo).
Ngoài ra tuỳ theo thứ tự sắp xếp của các nhóm chức trong không gian xung
quanh vị trí nguyên tử bất đối mà đồng phân đối quang có thể được gọi là đồng
phân (R) hoặc (S), (D) hoặc (L). Do danh pháp d, l và (D), (L) dễ bị nhầm lẫn,
các đồng phân đối quang thường được gọi là đồng phân (+), (-) hoặc (R), (S).
Tuy tính chất lý hoá của hai đồng phân rất giống nhau, hoạt tính sinh học của hai
đồng phân đối quang có thể rất khác nhau. Rất nhiều thuốc trên thị trường có
Châu Âu (European Medicinal Agency – EMEA) [15] đã ra hướng dẫn với các
thuốc mới cần xác định sự có mặt của các đồng phân đối quang. Nếu có, cần
nghiên cứu tách các đồng phân đối quang và tác dụng riêng rẽ của từng đồng 4
phân này. Từ đó đưa ra giải thích cho việc lựa chọn đơn đồng phân hoặc dạng
racemic cho chế phẩm.
Phần lớn những hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên hoặc bán tổng hợp tồn tại ở
dạng đơn đồng phân đối quang. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp, mặc dù một
đồng phân có tác dụng chính, vẫn được sử dụng chủ yếu ở dạng racemic. Từ kết
quả nghiên cứu về sự khác nhau giữa đặc điểm dược lực học và đặc điểm dược
động học của hai đồng phân đối quang, từ những năm 1990 bắt đầu xuất hiện
trào lưu mới, chuyển hoạt chất từ dạng hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân
(“chiral switch”). Ví dụ esomeprazole (S-omeprazol), S-salbutamol,
levofloxacin… Đối với những thuốc mới việc nghiên cứu chuyển từ dạng
racemic sang đơn đồng phân là một xu hướng khá phổ biến. Việc chuyển từ dạng
racemic sang đơn đồng phân có những ưu điểm sau [18]:
- Tăng tác dụng điều trị và chọn lọc với liều giữ nguyên hoặc giảm liều
- Giảm độc tính và tác dụng không mong muốn
- Giảm tương tác giữa các đồ ng phân đối quang và với các thuốc khác
- Dược lực học và dược động học có độ lặp lại tốt hơn
- Quan hệ liều – đáp ứng đơn giản hơn
Tuy nhiên không phải trường hợp chuyển dạng đồng phân nào cũng thành công.
Ví dụ R-thalidomid đ ã bị thu hồ i chỉ một thời gian ngắn sau khi đưa ra thị trường
do không làm giảm tác dụng không mong muốn so với dạng racemic như dự
đoán [27].
1.1.2 Phân tích đồng phân đối quang
Nhu cầu phát triển phương pháp cho phân tích đồng phân đối quang ngày càng
tăng. Trong nghiên cứu dược, việc phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa
các nhóm chính sau [4], [8]: 6
- Có bản chất protein: α1-acid glycoprotein, albumin huyết thanh, ovalbumin
- Dẫn chất polysaccarid: dẫn xuất cellulose, amylase
- Chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành "hốc" chọn lọc đối
quang (các cyclodextrin và dẫn xuất, ether vòng, polymer)
- Chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và
nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)
- Nhóm trao đổi ion (đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)
Các phương pháp phân tích các hợp chất đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC), và điện di mao quản (CE).
Trong đó HPLC và CE là hai kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất [16].
Nguyên lý HPLC
HPLC là kỹ thuật tách các chất dựa trên tương tác khác nhau của chất phân tích
với pha tĩnh và pha động, làm cho chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau
và được phân tách ra khỏi nhau [3]
Trong HPLC các đồng phân quang học trong hỗn hợp racemic có thể được tách
bằng một trong ba cách sau:
- Tạo dẫn xuất hoạt quang trước khi phân tích
- Thêm vào pha động tác nhân chọn lọc hoạt quang
- Sử dụng cột tách chọn lọc đối quang (chiral stationary phases): Tác nhân
chọn lọc hoạt quang được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh.
Trong đó sử dụ ng cột pha tĩnh hoạt quang là phương pháp phổ biến nhất do tính
tiện lợi, nhanh chóng và chính xác. Tuy nhiên một cột sắc ký hoạt quang thường
chỉ tách được một vài nhóm chất và chi phí của những cột này khá cao.
8
Tổng quan về các cyclodextrin
Cyclodextrin (CD) là các hợp chất thu đượ c từ phân huỷ tinh bột bằng enzym.
Về mặt cấu tạo, các cyclodextrin là oligosaccharid mạch vòng, gồ m 6 đến 12 đơn
vị D(+)-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid. Trong số đó,
các CD có 6,7,8 đơn vị D(+)-glucose (tương ứng với α, β, γ-CD) là được sử dụng
phổ biến [11]. CD có hình dạng như một hình nón cụt rỗng với một hốc kỵ nước,
và mặt ngoài thân nước do sự có mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của
glucopyranose). Các chất phân tích có thể tương tác với các CD tạo thành các
phức lồng. Cấu trúc của α, β, γ-CD được mô tả trong hình 1.1.
Hình 1.1: Cấu trúc và kích thước của các cyclodextrin tự nhiên [11]
Kích thước hốc kỵ nước của β-CD phù hợp với nhiều hợp chất hoá học. Độ tan
của β-CD là tương đối thấp hơn so với α- và γ-CD, tuy nhiên có thể được cải
thiện bằng cách tạo các dẫn xuất không mang điện tích như dẫn xuất methylat-,
hydroxy- ethylat-, hydroxypropylat- và các dẫn xuất mang điện tích như dẫn xuất
carboxymethylat-, sulphat-, phosphat-…Các dẫn xuất này có thể làm tăng sự
chọn lọc trong phân tích đồng phân đố i quang như làm tăng độ tan, khả năng tạo
các liên kết thứ cấp…Ngoài ra khi tác nhân chọn lọc đối quang mang điện tích
có chiều chuyển động ngược với chất phân tích sẽ làm tăng độ phân giải vì làm
tăng sự khác biệt về linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong 9
Hình 1.3: Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol
Tính chất lý hoá [21]:
- Là bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng 10
- Tan trong methanol, acid acetic, tan trong ethanol, ít tan trong aceton, thực tế
không tan trong acetoniril, chloroform.
- Nhiệt độ nóng chảy 146-148
o
C
- logP = 0,16
- pKa = 9,6
- Cực đại hấp thụ (dung dịch pha trong methanol): 225, 275, 283 nm
Dược lý và cơ chế tác dụng
Atenolol có tác dụng chống tăng huyết áp, thuộc nhóm chẹn chọn lọc trên thụ thể
beta
1
, làm giảm lực co cơ và tần số tim [2]. Nghiên cứu so sánh tác dụng giảm
nhịp tim của atenolol racemic và (R)-atenolol, (S)-atenolol trên người cho thấy
uống 100 mg atenolol racemic cho tác dụng tương đương với uống 50 mg (S)-
atenolol, trong khi không thấy tác dụng này sau khi uống 50 mg (R)-atenolol
[29]. Ngoài ra, (S)-atenolol ức chế β
1
-adrenergic chọn lọc hơn 40 lần và có ít tác
dụng phụ như loạn nhịp, đánh trống ngực hơn so với (R)-atenolol [22].
Như vậy trong hai đồng phân đối quang của atenolol, chỉ đồng phân (S)-atenolol
có tác dụng chẹn beta giao cảm. Đồng phân (R)-atenolol không những không có
tác dụng dược lý này, thậm chí còn có nhiều tác dụng không mong muốn hơn
đồng phân (S)-atenolol. Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự
[13]
(R,R)-
diaminocyclohexan-
dinitrobenzoyl
dichloromethan : methanol
98/2 (v/v)
huỳnh
quang
3
Santoro và Cho, 2000
[26]
Chiralcel OD (250 x
4,6 mm; 10 µm)
Hexan - ethanol - diethylamine
= 75: 25: 0,1
UV
4
Eaga et al., 2010 [12]
Chiralcel AGP (150 x
4.0 mm, 5 µm)
đệm phosphat pH 7 - methanol
(95:5)
UV
5
Hefnawy et al., 2013
[17]
Chirobiotic V
MeOH: acid acetic băng:
triethylamin = 100:0.025:0.75
huỳnh
50 cm x 75 µm
I.D.
10 kV
28 mM Me-β-CD, đệm
20 mM Tris - acid
phosphoric, pH 2,4
(-) atenolol: 17,15
(+) atenolol: 17,37
2
Wren và
Rowe
1993 [31]
57 cm x 50 µm
I.D.
25
o
C, 20
kV
40 mM Me-β-CD 50
mM lithium phosphat
pH 3,0
Khoảng 25 phút
3
Aumatell
et al. 1994
[7]
100 cm x 50
µm I.D.
20 kV
2,0 mM SBE-β-CD, 20
Li et al.
2010 [20]
48,5 cm x 50
µm I.D.
20
o
C, 24
kV
8mM CM- β -CD
50mM Tris, H
3
PO
4
pH 4,0
Từ 17 – 18 phút
Các nghiên cứu ở trong nước
Ở Việt Nam, phân tích đồng phân đối quang atenolol đã được thực hiện bằng kỹ
thuật HPLC [5] và CE [6].
Một số thông số của phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol
bằng HPLC [5]:
- Cột Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(α-
naphtyl)ethylamine) kích thước 4,0 x 250 mm; 5 µm.
- Pha động: n-hexan/ 1,2 dicloromethan/ methanol / acid trifluoroacetic tỷ lệ
57,5/35/7,5/0,2 (v/v/v/v), Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
- Detector UV, bước sóng phát hiện 229 nm
- Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml (racemic), Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. 13
hạn dùng: 04/11/18, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-VN.
- Mẫu placebo: chứa các thành phần tá dược của viên do công ty STADA
cung cấp gồm: tinh bột ngô, tinh bột tiền hồ hóa, lactose monohydrat,
povidon K25, natri laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat.
2.1.2. Hóa chất
- Chất chuẩn atenolol (racemic), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
hàm lượng: 100,17 %, độ ẩm: 0,11 %, số kiểm soát: 0102093.
- Chất chuẩn S-atenolol, hãng sản xuất Sigma – Aldrich, Mỹ, hàm lượng 99
%, số lô 021M4620V.
- Carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD), dạng muối natri, Sigma-
Aldrich, Mỹ, số lô BCBK3651V.
- Natri hydroxyd Merck KGaA, Đức.
- Tris (hydroxymethyl amino methan (Tris) Merck KGaA, Đức.
- Acid phosphoric 85 % Merck KGaA, Đức
- Acid hydrochloric Merck KGaA, Đức
- Methanol Merck KGaA, Đức.
2.1.3. Trang thiết bị
- Máy điện di mao quản Agilent, model: G1600AX, số seri: DE1603499,
Agilent, Mỹ.
- Cột mao quản silica nung chảy, có vỏ bao polyimid loại có chiều dài hiệu
dụng 40,0 cm, chiều dài tổ ng cộng 48,5 cm, đường kính trong 50 µm,
Agilent, Mỹ.
- Máy đo pH (744 pH meter), Metrohm, Thụy Sỹ. 15
- Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, d = 0,1 mg và XS105DU, d = 0,01
mg, Thụy Sỹ.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, Elma, Đức
- Máy cất nước hai lần Hamilton WSC/4D, Anh.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di
Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi đưa ra một số điều kiện điện di ban
đầu và khảo sát thêm một số điều kiện điện di: cột mao quản, dung dịch đ iện
ly nền, nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang, điện thế.
Lựa chọn cột mao quản
Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt)
với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau.
Lựa chọn dung dịch điện ly nền
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt) sử dụng
dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0,
chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-
CD 8 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện
ly nền thích hợp.
Lựa chọn điện thế
Thay đổi điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (∆E= 5 kV) và
tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn điện thế phù hợp.
Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang
Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm với điều kiện điện
di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang CM-β-
CD từ 6 mM đến 10 mM. Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn
nồng độ CM-β-CD thích hợp. 17
Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân đối quang
Điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm và dung dịch chuẩn (S)-
Copyright: Tài liệu đại học ©