BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


HÀ THỊ MAI HẠNH
XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ
CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM
TPCN DẠNG BỘT CHỨA
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HÀ THỊ MAI HẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH
LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ
CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM
TPCN DẠNG BỘT CHỨA
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh
2. DS. Nguyễn Thị Quế Mai


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo: 2
1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2
1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo 2
1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo 2
1.1.4. Tác dụng Đông trùng hạ thảo 4
1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin 6
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 6
1.2.2. Dƣợc động học cordycepim và adenosin 6
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosine 7
1.3. Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine 8
1.3.1. Một số nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng
pháp HPLC 8
1.3.2. Các nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng pháp
khác 12
1.4. Đại cƣơng về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13
1.4.1. Nguyên lý và các thông số đặc trƣng của sắc ký lỏng 13
1.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14
1.4.3. Ứng dụng 15
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị: 18
2.1.1. Thiết bị - dụng cụ 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC 45 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tiếng Anh hoặc tên khoa học
Tiếng Việt
ACN
Acetonitril

AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà Hóa
phân tích
CE
Capillary electrophoresis
Điện di mao quản
DD

Dung dịch
DMSO
Dimethyl sulfoxide

ĐTHT

Đông trùng hạ thảo
EtOH
Ethanol

Standard deviation
Độ lệch chuẩn
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UV
Ultraviolet
Tử ngoại
VIS
Visible
Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số phƣơng pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin. 9
Bảng 2.1. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm. 18
Bảng 3.1. Cách pha dãy dung dịch chuẩn 23
Bảng 3.2. Khảo sát thành phần pha động 26
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát chƣơng trình gradient 1, 2, 3 26
Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết 30
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và
diện tích pic 33
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp 35
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phƣơng pháp 36
Bảng 3.8. Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo đƣợc gửi tới
Viện TPCN 37

Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu trắng 32
Hình 3.10. Đƣờng chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34
Hình 3.11. Đƣờng chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo là một loại dƣợc liệu quý hiếm có từ rất lâu trên thế giới,
sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xƣa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc “cải
lão hoàn đồng”, “hồi xuân sinh lực”. Mặt khác, các nghiên cứu y học cổ truyền hiện
đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu nhƣ không có tác dụng phụ đối với cơ thể
ngƣời. Trong Đông trùng hạ thảo có nhiều loại nucleosid, đây là thành phần có hoạt
tính chính, trong đó có adenosin và cordycepin là hai thành phần có vai trò quan
trọng trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của cơ thể nhƣ: giúp cải thiện tuần hoàn
ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lƣợng cơ bắp, giảm sinh trƣởng của tế bào
xấu, tăng lƣợng oxy trong máu… Vì vậy, trên thị trƣờng càng ngày càng có nhiều các
dòng sản phẩm Thực phẩm chức năng chứa loài dƣợc liệu quý hiếm này để phục vụ
cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của ngƣời dân.
Với việc sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo đòi
hỏi có các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng của chúng bởi trên thực tế các sản phẩm
này có giá thành rất đắt nhƣng khi phân tích, chất lƣợng rất khác nhau. Trong Dƣợc
điển Trung Quốc đã đƣa ra chuyên luận đánh giá dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo
Cordyceps sinensis với thành phần adenosin, nhƣng thành phần cordycepin chƣa
đƣợc đánh giá. Vì vậy việc xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hai thành phần này

[32].
Tại Trung Quốc, ĐTHT thƣờng gặp ở những rừng ẩm ƣớt các tỉnh Tứ Xuyên,
Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng, nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [13].
1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo
Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm
thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣa vào
nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr)
Link.
1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo
ĐTHT chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học nhƣ : các nucleosid; sterol;
các acid hữu cơ; các loại đƣờng mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid; các
protein; polyamin; vitamin và rất nhiều khoáng chất.
3

Các nucleosid:

Guanosin

Uridin

Cytisin Thymidin
Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo[30].
Các nucleosid là một trong những thành phần có hoạt tính trong ĐTHT, trong
đó adenosin, cordycepin đƣợc sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lƣợng của
ĐTHT. Có hơn 10 loại nucleosid và các chất tƣơng tự đƣợc tìm thấy trong ĐTHT tự
nhiên hay nuôi trồng nhƣng hàm lƣợng khác nhau [16]. Một nghiên cứu cho thấy
nồng độ adenosin đƣợc tìm thấy trong ĐTHT nuôi trồng cao gấp 6 lần so với tự

12
, vitamin A,
vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B
2
, vitamin E, vitamin K…
Ngoài ra còn có các hợp chất hydrocacbon, alcohol và aldehyd…
1.1.4. Tác dụng Đông trùng hạ thảo
ĐTHT là một vị thuốc đƣợc ghi vào tài liệu thuốc đông y vào giữa thế kỷ 18
trong bộ “bản thảo cƣơng mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ, ĐTHT có vị ngọt,
tính ấm quy vào 2 kinh phế và thận, có công năng dƣỡng phế, bổ thận, ích tinh đƣợc
dùng để trị phế hƣ khái xuyễn, liệt dƣơng, di tinh, đau lƣng mỏi gối. 5

Tác dụng chống oxy hóa, tăng cường sức khỏe
ĐTHT chứa nhiều chất chống oxy hóa cao, làm chậm quá trình lão hóa của cơ
thể [27].
Tác dụng chống ung thư
Các nghiên cứu lâm sàng đƣợc tiến hành tại Trung Quốc và Nhật Bản cho thấy
ĐTHT có tác dụng làm giảm kích thƣớc của khối u và chống lại ung thƣ [8].
Nâng cao khả năng miễn dịch
Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh ĐTHT có khả năng tăng cƣờng
hoạt động miễn dịch tế bào cũng nhƣ miễn dịch dịch thể. Cụ thể là tác dụng nâng
cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào NK, điều tiết phản ứng của tế bào lympho
B, tăng cƣờng một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ
các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh [8].
Tác dụng chống viêm
ĐTHT tác dụng tăng sản xuất interleukin-10, giảm sản xuất interleukin-2, làm
tăng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi nên có tác dụng chống viêm, ức chế sự

O
4
Trọng lƣợng phân tử: 267,24g/mol
Điểm chảy: 234 – 235
o
C
Độ tan: tan tốt trong nƣớc, DMSO,
tan không đáng kể trong ethanol.
Hình 1.3. Công thức cấu tạo cordycepin
Tên khoa học:
9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin
Công thức phân tử: C
10
H
13
N
5
O
3
Trọng lƣợng phân tử: 251,24g/mol
Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột
hoặc tinh thể bông tuyết.
Điểm chảy: 228 – 231
o
C
Độ tan: tan trong DMSO, methanol,
ethanol.

8

Tác dụng của adenosine
Adenosin liều cao làm tăng dẫn truyền nhĩ – thất, giảm đƣợc hiện tƣợng “ tái
nhập” nhĩ – thất. Hồi phục đƣợc nhịp xoang ở ngƣời bị rối loạn nhịp nhanh trên thất
kịch phát [1]. Chức năng chính của adenosine là ngăn ngừa tổn thƣơng mô trong
trƣờng hợp thiếu oxy, thiếu máu cục bộ, co giật, tăng cƣờng tuần hoàn mạch vành,
mạch não và điều hòa nhịp tim. Đồng thời adenosin trực tiếp kiểm soát các chức
năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim,
ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất do đó adenosin đƣợc dùng làm thuốc
điều trị rối loạn nhịp tim [10]. Adenosin cũng có tác dụng tốt với rối loạn thần kinh
nhƣ: thiếu máu não cục bộ, động kinh, các bệnh thoái hóa thần kinh và đau thần
kinh [9].
Adenosin còn có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau
liên quan đến đƣờng hô hấp nhƣ bạch cầu trung tính, bạch cầu ƣa acid, tế bào
lympho và đại thực bào.
1.3. Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine
1.3.1. Một số nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp
HPLC
Có nhiều phƣơng pháp phân tích adenosin và cordycepin nhƣng phƣơng pháp
HPLC đƣợc sử dụng nhiều nhất.

9

Bảng 1.1. Một số phương pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin.
Tài liệu
Mẫu
thử
Detector
Cột sắc ký

B; 12 – 15 phút: 85 –
100% B
- Bƣớc sóng: 260 nm
- Nhiệt độ cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng:
1ml/phút
- Nhiệt độ cột: 40
o
C
- Thể tích tiêm mẫu:
20µL
Methanol:
H
2
O = 1 : 9
Jian – Ping
Yuan và
cộng sự
[28]

Một số
loài nấm
PDA
Cột ZORBAX
Eclipse XDB-C18
(4,6 mm × 250
mm, 5 µm) và
một cột bảo vệ

Xie và cộng
sự [24]
ĐTHT
khô
MS
Cột VP-ODS
Shimadzu
(150mm × 4,6
mm × 5 µm)

DD Ammoni acetat
0,04M pH 5,2 (A) và
Methanol (B) theo
chƣơng trình gradient:
0 – 6 phút: 85% A; 6 –
12 phút: 85 – 80% A;
12 – 17 phút: 80% A;
17 – 20 phút: 95% A

- Chế độ ion hóa ESI
+
- MS lựa chọn ion [M
+ H]
+
tại m/z 127,
136, 268, 252 và 302
- Nhiệt độ 400
o
C
- Điện áp đầu dò là

ml/ phút.
- Nhiệt độ cột : nhiệt
độ phòng
Ethanol
20,21%
Lan – Fang
Huang và
cộng sự
[12]

MS
Cột VP – ODS
(2,0 × 150 mm)
H
2
O : Methanol : Acid
formic = 85 : 14 :1
- Chế độ ion hóa ESI
+
- Lựa chọn ion [M +
H]
+
tại m/z là 136,
137, 268, 252, 302

Xiao Feng
Xue và

O = 7 :
93
- Bƣớc sóng: 260 nm
H
2
O
Hemanth
Kumar, M.
Spandana
[14]
ĐTHT
khô
UV
Cột ProtoSIL C
18

(250mm × 4.6
mm × 5µm)
Methanol : H
2
O = 20 :
80
- Bƣớc sóng: 254 nm
- Tốc độ dòng:
1mL/phút
- Nhiệt độ cột: 30⁰C
- Thời gian rửa giải:
30 phút
Ethanol
Hardeep S.

Militaris
khô
PDA
Waters Symmetry
Shield RP 18 (4.6
× 150
mm, 5 µm)
Methanol : H
2
O = 8 :
92

- Bƣớc sóng: 254 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml
/ phút
- Thời gian rửa
giải:15 phút
- Nhiệt độ cột: 30⁰C
Methanol :
H
2
O = 5 : 5
12

1.3.2. Các nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp
khác
Phương pháp sắc ký bản mỏng
Nghiên cứu của MA King Wah và các cộng sự [17] tiến hành xác định
cordycepin và 7 nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phƣơng pháp sắc
ký lớp mỏng sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nƣớc của 11 sản phẩm

MS với pha động là đệm formic 10 mM chứa 10 % methanol, tốc độ dòng 3
µL/phút. Phƣơng pháp cho kết quả hàm lƣợng nucleosid và nucleobase trong
13

Cordyceps sinensis là 9138 ± 4823 µg/g cao hơn so với C.militaris là 3722 ± 1446
µg/g.
1.4. Đại cƣơng về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1. Nguyên lý và các thông số đặc trưng của sắc ký lỏng
Nguyên lý:
Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong pha động. Pha tĩnh đƣợc cố định trong cột
hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột
theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tƣơng tác giữa pha tĩnh, pha động
và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích
với hai pha dẫn đến sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các
dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lƣợng, sự tách này đạt đƣợc do quá
trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Các chất sau khi đƣợc rửa giải ra khỏi cột
đƣợc nhận biết bởi bộ phận phát hiện detector.
Các thông số đặc trƣng cho quá trình sắc ký [2]
- Thời gian lưu( t
R
): là thời gian cần thiết để chất tan di chuyển từ nơi tiêm
mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic. t
R
là thông tin về mặt định
tính trên sắc ký đồ của một số chất tan trong điều kiện nhất định.
- Độ phân giải R
s
( Resolution): là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ tách của
hai chất ra khỏi nhau trên cùng một điều kiện sắc ký:
R

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.
- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy
tính) [5].

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thƣờng chia làm 2 loại : sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC đƣợc sử dụng rộng rãi vì tách và phân tích đƣợc
nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực, ít phân cực đến không phân
cực. Đồng thời thành phần chính của pha động là nƣớc nên rất kinh tế.
15

Pha động trong sắc ký lỏng
Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích
trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho
nó để có đƣợc hiệu quả tách tốt.
Có thể chia pha động làm hai loại:
- Pha động có độ phân cực cao
- Pha động có độ phân cực thấp
Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa
giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân
cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động
theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.
Detector trong sắc ký lỏng
Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phƣơng pháp. Có
nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa
chọn detector cho phù hợp:

Trong khuôn khổ khóa luận này, tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng pháp
chuẩn ngoại. Đây là phƣơng pháp định lƣợng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và
thử tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của
mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính đƣợc nồng độ của các
chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn
hóa nhiều điểm.

Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ
của mẫu thử theo công thức:
Trong đó:
C
x
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử.
C
s
: Nồng độ chất chất phân tích trong mẫu chuẩn.
S
x
(H
x
): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử.
S
s
(H
s
): Diện tích ( chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.
17

Chuẩn hóa nhiều điểm