BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VƯƠNG LAN HƯƠNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI, 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VƯƠNG LAN HƯƠNG
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI LAMIVUDIN,
ZIDOVUDIN & NEVIRAPIN TRONG
CHẾ PHẨM VIÊN NÉN BẰNG MEKC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Thùy Linh
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất
Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI, 2013
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I: TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin 3
1.1.1 Tổng quan chung 3
1.1.2 Dược động học 4
1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV 6
1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản 8
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản 8
1.2.2 Các kiểu điện di mao quản 10
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điện di 12
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC) 12
1.2.5 Ưu - nhược điểm của MEKC 17
1.3 Một số nghiên cứu gần đây về tách và định lượng đồng thời 3TC, AZT
& NVP 18
1.3.1 Phương pháp HPLC 18
1.3.2 Phương pháp CE 20
PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Điều kiện nghiên cứu 21
2.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu 21
2.1.2 Hóa chất 21
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 23
2.2 Đối tượng nghiên cứu 23
2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24
2.3.1 Nội dung nghiên cứu 24
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 24
3.1 Lựa chọn điều kiện điện di tối ưu 27
3.1.1 Lựa chọn bước sóng 27
3.1.2 Điều kiện điện di 28
3.1.3 Lựa chọn phương pháp bơm mẫu 29
3.1.4 Lựa chọn kiểu điện di 30
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người ( Acquired
immunodeficiency syndrome)
AZT
Zidovudin
C
Nồng độ
CE
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)
CEC
Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)
CGE
Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)
CZE
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)
C
max
Nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương
DAD
Detector mảng diod (Diod Array Detector)
EOF
Thời gian để đạt C
max
T
m
Thời gian di chuyển
T
nc
Nhiệt độ chảy
UV – VIS
Bước sóng tử ngoại - khả kiến (Ultra Violet – Visiable)
WHO
Tổ chức Y tế thế giới (World Heal Organization)
3TC
Lamivudin
ddC
Zalcitabine
ddI
Didanosine
11
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Lamivudin
12
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Zidovudin
13
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp trên thêm chuẩn
Nevirapin
14
Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N 15
Kết quả định lượng viên nén Lamivudin 150mg & Zidovudin
300mg
O
7
10mM/ SDS 50mM ở các pH khác nhau
11
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ borat khác nhau
12
Điện di đồ hỗn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền ở các nồng
độ SDS khác nhau
13
Điện di đồ hốn hợp 3 chuẩn với dung dịch điện ly nền borat
10mM/SDS 50mM ở các thế khác nhau
14
Điện di đồ hỗn hợp chuẩn với thời gian tiêm mẫu khác nhau
15
Điện di đồ hỗn hợp thử 16
Điện di đồ mẫu thử thêm Lamivudin chuẩn
17
Điện di đồ mẫu thử thêm Zidovudin chuẩn
18
Điện di đồ mẫu thử thêm Nevirapin chuẩn
19
Điện di đồ hỗn hợp chuẩn ở diều kiện điện di tối ưu
20
Điện di đồ mẫu trắng
21
trị cũng góp phần quan trọng không kém. [10]
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều thuốc dùng để điều trị HIV. Tuy
nhiên, theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO, để điều trị HIV nên
dùng phối hợp hai thuốc NRTIs hoặc cùng phối hợp với một thuốc NNRTIs
mà không nên đơn trị liệu vì có thể dẫn đến kháng thuốc, làm giảm hiệu quả
điều trị. [3], [11], [13]
Xuất phát từ nhu cầu đó, trên thị trường bắt đầu xuất hiện những thuốc
ở dạng hỗn hợp đa thành phần. Chế phẩm chúng tôi dùng nghiên cứu cũng là
một trong số đó. Vì vậy, việc kiểm tra chất lượng cũng như xác định các
thành phần trong chế phẩm hỗn hợp đóng một vai trò hết sức quan trọng trong
việc đảm bảo chất lượng thuốc, đem lại sự an toàn, hiệu quả cho người sử
dụng.
Hiện nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích
được đa số các Dược điển quốc tế lựa chọn trong kiểm nghiệm thuốc điều trị
HIV. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác cao,
khả năng tách tốt, độ nhạy cao và giới hạn phát hiện nhỏ. Tuy nhiên, phương
pháp này đòi hỏi phải sử dụng một lượng lớn dung môi tinh khiết, đắt tiền,
nhiều loại dung môi có thể gây độc với người phân tích và ô nhiễm môi
trường. Đồng thời phương pháp này tương đối hạn chế trong việc phân tích
2
các chất có khả năng ion hóa, nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo RP –
HPLC (Reversed – phase liquid chromatography). [16], [17]
Nhằm mục đích xây dựng một phương pháp nghiên cứu phân tích ít tốn
kém và ít độc hại hơn, chúng tôi hướng đến phương pháp điện di mao quản.
Đã có nhiều nghiên cứu phân tích 3TC, AZT & NVP bằng phương pháp
HPLC. Tuy nhiên, chưa thấy một nghiên cứu nào phân tích định lượng đồng
thời ba chất đó bằng phương pháp CE. Mặt khác, CE tuy không còn mới lạ
trên thế giới, nhưng ở Việt Nam, việc ứng dụng CE vào trong kiểm nghiệm
dược phẩm vẫn còn rất hạn chế. Với những mục đích trên, đồng thời nhằm
nâng cao chất lượng việc xây dựng tiêu chuẩn và quản lý các thuốc điều trị
8
H
11
N
3
O
3
S
C
10
H
13
N
5
O
4
C
15
H
14
N
4
O
PTK
229,3 g / mol
267,2 g/mol
266,3 g/mol
Tên KH
4-Amino-1-
120 – 122
0
C
242 – 246
0
C
Độ tan
Dễ tan trong nước,
tan trong cồn, khó
tan trong các dung
Khó tan trong nước,
EtOH
Thực tế không tan
trong nước, ít tan
trong CH
3
Cl.
4
môi hữu cơ không
phân cực
pKa
4,3
9,68
2,8
Năng
suất quay
cực
- 135
0
(C = 0,38%
>90%, không bị ảnh
hưởng bởi thức ăn
hoặc thuốc kháng
acid
Tmax
1h sau khi uống
0,5 – 1h sau khi
uống
4h sau khi dùng liều
duy nhất
Cmax
1,5 µg/ml (liều
150mg)
1,2 mg/l ( liều
250mg )
5,74 µg/ml (liều
200mg)
Phân bố
Vd = 1,3 ± 0,4
lit/kg
Vd = 1,6 ± 0,6 lit/kg
Nevirapin đi qua
được nhau thai và
hàng rào não tủy,
phân bố trong dịch
não tủy và sữa mẹ.
Vd = 1,21 0,09
lit/kg
5
Liên kết
Thải trừ
70% thải trừ dưới
dạng còn nguyên
vẹn qua nước tiểu
70% liều uống (40-
60% liều tiêm
truyền) được thải trừ
dưới dạng chuyển
hóa qua nước tiểu
10 -20% liều uống
(15 – 30% liều tiêm
truyền) được thải trừ
dưới dạng không đổi
qua nước tiểu
>70% thải trừ qua
nước tiểu dưới dạng
chuyển hóa.
Độ thanh
thải Cl
0,37 ± 0,05
lit/giờ/kg
0,2 – 0,3 lit/giờ/kg
0,017 – 0,032
lit/giờ/kg
6
1.1.3 Ứng dụng Lamivudin, Zidovudin & Nevirapin trong điều trị HIV
1.1.3.1 Các nhóm thuốc điều trị HIV
- Nhóm 1: Thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleoside
(nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs)
một thuốc mà kết hợp 2 thuốc mới.
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleoside có tác dụng
kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzyme phiên mã
ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng
retrovirus để điều trị HIV.
Nevirapin là chất ức chế enzyme phiên mã ngược non-nucleosid có hoạt
tính kháng retrovirus HIV-1.
Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin là ba thuốc phối hợp được tổ chức Y
tế thế giới WHO khuyến cáo dùng trong điều trị HIV.
Liều dùng:
- Nevirapin 200mg/lần/ngày (trong hai tuần đầu), sau đó 200mg/2 lần/ngày
- Zidovudin 300mg/ 2 lần/ngày. Bệnh nhân bị suy giảm chức năng thận
hoặc phải điều chỉnh liều do bị nhiễm độc tố không được sử dụng viên
phối hợp.
- Lamivudin 150mg/2 lần/ngày
Nevirapin được khuyến cáo nên dùng nửa liều trong vòng 14 ngày đầu để
làm giảm nguy cơ phát ban. Theo lưu ý trên, trong suốt thời kì này, không nên
sử dụng viên nén phối hợp 3 thành phần trên. Không nên cố gắng sử dụng
một viên/ ngày, vì điều đó có thể dẫn đến việc kháng Lamivudin và điều trị
thất bại. Thay vì đó, nên sử dụng những viên riêng biệt. Sau 14 ngày, liều của
Nevirapin nên được tăng lên 200mg/2 lần/ ngày hoặc có thể sử dụng viên
thuốc phối hợp.
8
Viên phối hợp Zidovudin/Lamivudin không phù hợp với những người bị
suy thận hoặc những bệnh nhân sử dụng liều Zidovudin thấp hơn do tác dụng
phụ
1.2 Cơ sở lý thuyết điện di mao quản [1], [2], [9], [14], [15]
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hóa từ thuật
ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
1.2.1 Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản
tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế Zeta.
Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán sẽ di
chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hóa nên kéo theo cả
khối dung dịch trong mao quản đi về catod. Sự di chuyển của khối dung dịch
trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường được gọi là dòng điện
thẩm EOF.
Hai đặc điểm của EOF
- Đặc điểm đầu tiên của EOF là tạo nên một dòng chuyển khối phẳng trong
mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng nhất dọc
theo mao quản, cho nên không có sự sụt áp trong mao quản: dòng đồng
nhất từ đầu đến cuối (mao quản).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di chỉ
xuất hiện khi đường kính trong mao quản (d
i
) dưới 200µm. Nếu d
i
200µm,
sức căng bề mặt không đủ tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng
ở giữa và ở gần thành mao quản.
10
- Đặc điểm thứ hai của EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung
dịch điện di, bất kể có điện tích hay không, di chuyển theo cùng hướng.
Với điều kiện điện di thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc
độ EOF thường lớn hơn rất nhiều lần so với tốc độ điện di.
Hình 2: Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo
Cơ chế tách
Ứng dụng
1
Điện di mao quản vùng
(Capillary zone
electrophoresis: CZE)
Dựa trên linh
độ khác nhau
của các ion
trong dung dịch
tự do
-Sinh học: phân tích các
peptid, protein, dặc biệt là
glucoprotein
-Xác định dược chất và các
chất chuyển hóa của chúng
-Phân tích các chất ô nhiễm
môi trường
2
Sắc kí điện động
micelle (Micellar
electrokinetic
chromatography:
MEKC)
Dựa trên sự
tương tác
nước/ion với
hạt micelle
trong dung
dịch.
1.2.3.1 Điện thế
Thời gian phân tích tỉ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao quản. Tuy
nhiên, nếu điện thế quá cao có thể gây ra hiệu ứng June, tạo ra nhiệt trong
mao quản, làm thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong mao quản, khiến cho các
phân tử chất tan di chuyển không đồng nhất, dẫn đến sự khuếch tán khác nhau
và làm mở rộng vùng mẫu.
1.2.3.2 Nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của dung dịch
điện ly nền. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ mao quản tăng là nguyên
nhân thay đổi cấu trúc protein, làm thay đổi thời gian điện di và hiệu quả phân
tích.
1.2.3.3 Dung dịch điện ly
- Loại dung dịch điện ly và nồng độ: dung dịch điện ly thích hợp cho CE khi
có tác dụng tốt nhất trong dãy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt
trong dung dịch ấy
- pH: pH của dung dịch điện ly có thể tác dụng lên khả năng phân tích và
làm thay đổi EOF.
1.2.3.4 Cột mao quản
Kích thước cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng đến thời
gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài hiệu dụng
và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng thời gian phân
tích.
1.2.4 Điện di mao quản micelle (MEKC)
MEKC có khi còn được viết tắt là MECC (micellar electrokinetic capillary
chromatography) là một kỹ thuật bổ sung cho CZE: tách được ion và cả phân
tử trung hòa điện bằng cách thêm các chất hoạt động bề mặt vào dung dịch
13
điện di ở nồng độ trên nồng độ micelle tới hạn (critical micelle concentration
– CMC). Chất hoạt động bề mặt thường dùng là natri dodecylsulfat (SDS) có
CMC = 9mM. Và đây cũng là chất diện hoạt chúng tôi sử dụng trong nghiên
tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá
trình điện di.
Hình 4 : Cấu trúc của các micelle và dòng EOF trong MEKC
Đối với các phân tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan
vào trong micelle và ở ngoài micelle (pha động điện di) theo một cân bằng
động học có hằng số phân bố K
i
nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự
phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các
chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký của các chất phân tích theo kiểu micelle. Vì
thế các micelle trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh
giả. Nhiều chất tương tác với micelle khá bền, nó tồn tại trong micelle dài hơn
sự di chuyển của nó, khi các micelle mang nó một phần di chuyển ngược
chiều dòng EOF.
Copyright: Tài liệu đại học ©