BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘINGUYỄN BÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL
TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘINGUYỄN BÌNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2013
Sinh Viên

Nguyễn Bình Nguyên
MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương I : TỔNG QUAN 2
1.1 Đại cương về Captopril 2
1.1.1 Công thức, tính chất 2
1.1.2 Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định 2
1.2 Một số phương pháp định lượng captopril 3
1.2.1 Đinh lượng Captopril bằng phép đo Iod 3
1.2.2 Định lượng Captopril bằng phương pháp đo quang 4
1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 5
1.3.1 Định nghĩa 5
1.3.2
Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký 5
1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 7
1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn sắc ký 7
1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 11
1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 12
1.4.1 Yêu cầu chung 12
1.4.2 Nội dung thẩm định phương pháp 12
Chương II: ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1 Đố
i tượng nghiên cứu 14
2.2 Dụng cụ, hóa chất 14
2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 14

AcCN : Acetonitril
AF : Hệ số bất đối xứng(Asymmetric)
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography).
MeOH: Methanol
RSD : Độ lệch chuẩn tương đối(Relative Standard Deviation)
R
s
: Hệ số phân giải (Resolution)
TB : Trung bình

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Nội dung Trang
1.1 Cấu trúc cột LC-DB 9
1.2
Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
9
3.1
Phổ hấp thụ UV của Captopril trong MeOH:Đệm phosphat 0,01M
pH=2,40 (65:35)

17
3.2
Sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở các hệ đệm khác nhau và các
pha động khác nhau.
19
3.3 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,50 20
3.4 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,40 20
3.5 Thông số phân tích và sắc ký đồ của Captopril khi chạy ở pH =2,30 21
3.6

Cách pha dãy dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính
28
3.3
Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Captopril
29
3.4
Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp
30
3.5 Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp 31
3.6
Kết quả định lượng Captopril trong Captopril nguyên liệu của công
ty dược phẩm Traphaco

36
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, tăng huyết áp là một bệnh mang tính chất phổ biến. Điều đáng ngại
chính là có tới 50% người bị tăng huyết áp không biết mình bị tăng huyết áp,
khoảng 30% của những người đã biết mình tăng huyết áp nhưng vẫn không có một
biện pháp điều trị nào.Tăng huyết áp nếu không được điều trị đúng và đầy đủ dẫn
đến nhiều biến chứng nặng nề như suy thận, suy tim, tai biến mạch não… thậm chí
có thể gây tử vong hoặc để lại các di chứng nặng nề ảnh hưởng đến sức khỏe, sức
lao động của người bệnh. Một trong những thuốc đầu tay bác sỹ hay dùng để điều
trị tăng huyết áp trên bệnh nhân đó chính là nhóm ức chế men chuyển trong đó
Captopril là một thuốc kinh điển.
Muốn kiểm soáttốt các chế phẩm chứa Captopril thì đi từ việc nhỏ nhất đó là
đánh giá được nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc Captopril. Hiện nay, ở Việt
Nam, phương pháp chính để định lượng Captopril trong nguyên liệu là phương

H
15
NO
3
S ; M=217,28;
 Tính chất:
Bột kết tinh màu trắng ngà,ở 25
o
C: tan tốt trong nước (160 mg/ml),
ethanol,methanol,methylclorid, tan trong glyceryltriacetat (20 mg/ml),trong dung
dịch NaOH loãng, rất ít tantrong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml).Nhiệt độ nóng
chảy: 105
o
C – 108
o
C.Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là α
D
25
= -
127,8
o
,hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5
o
. Hằng số phân ly
trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH). Hệ số phân bố
logP(octhanol/nước) =0,34, logP(CH
2
Cl
2
/nước(pH=2))=1,39, logP(octhanol/HCl

Liều dùng:Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự
tăng giảm phụthuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu
thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày.Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75-100
mg/ngày,với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉ
nh liều cho phù hợp với từng đối
tượng. Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày ở bảng1.1
Bảng 1.1 : Một số chế phẩm có chứa Captopril
Biệt dược Nồng độ/Hàm lượng Dạng thuốc Hãng sản xuất
Lopril Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Viên nén
Bristol-myers
Ssquibb
Ecazide Captopril 50 mg +
Hydroclothiazid
25mg
Bristrol-myers
Ssquibb
Captopril
STADA®25
Captopril 25 mg Stadapharm GmnH
DH-CaptoHasan Captopril 25 mg Hasan
1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CAPTOPRIL
1.2.1. Định lượng Captopril bằng phép đo Iod
Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I
2
. Hòa tan 0,15g chế phẩm
trong 30,0 ml nước cất. Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M. Xác định điểm kết
thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin).[1]
4

. Tạo
muối diazoni bằng cách cho thêm sulfanilamine. Sau đó thêm N-(1-
napthyl)ethylenediamine tạo phẩm màu azo có màu đỏ.Tiến hành đo mật độ quang
của dung dịch.[10]
Phương trình phản ứng:
RSH
HNO
2
RS
NO
HNO
2
HNO
2
Hg
++
H
2
O
+
S
NH
2
OO
NH
2
H
2
NSO
3

Nhận xét :
5  Cách tiến hành định lượng phức tạp vì nhiều giai đoan khó thực hiện, sản
phẩm đo quang là chất trung gian dễ bị phân hủy,làm giảm sự chính xác của phép
định lượng.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích có tính
ổn định, độ chính xác và độ chọn lọc cao được sử dụng rộng rãi trong phân tích và
dược phẩm.Vì vậy trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng phương pháp
định lượng Captopril trong nguyên liệu bằ
ng HPLC.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã
được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion,
loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt.[5]
1.3.2. Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký
 Thời gian lưu t
R
:
Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho pic trên sắc ký đồtính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ, nó
là hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không
đổi. Ngoài ra trong một phép phân tích còn th

M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động
 Hệ số dung lượng k’ : cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai
pha và được tính theo sức chứa của cột:
k’ = k
x




=




=




=







k’ : tối ưu trong khoảng : 1≤ k ’≤8 [5]
 Hệ số chọn lọc α :

a : là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic
đếnmép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N :
Hiệu lực cột được đo bằng thống số : Số đĩa lý thuyết N của cột
N = 5,54 x



/
[5]hoặc16 x



[5]
Trong đó : W
1/2h
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic.
 Độ phân giải R
s
của cột :
R
s
=
.






(R)B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A).
7 W
B
; W
A
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Yêu cầu : R
S
> 1 ; giá trị tối ưu R
s
= 1,5.[5]

1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
các bộ phận chính sau :
 Bơm cao áp :
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường 0– 400 bar)để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù
hợp với quá trình sắc ký.
 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi :
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh đôi khi bằng thép không gỉ.

2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon.Trong sắc ký hấp phụ
pha đảo: pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc Siloxan:
 R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –CH
2
-
NH
2
, alkyl nitril – CH
2
– CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận
để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.[15]
 Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế
bàng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của
mạch carbon (C
2
;C
8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm OH thân
nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica
đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân
cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.[5]
9

bằng những nhóm
thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽche chắn đi những nhóm –OH,
được trình bày ở hình 1.2.
10
Hình 1.2 : Cấu trúc cột có gốc Isopropyl
Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C
18
một số nhóm phân
cực để tăng thêm độ phân cực của dây C
18
làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn
đối với những hợp chất phân cực mạnh (Cột EPS – Expended Polar Selectivity)[15]
1.3.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha
động là dung môi phân cực như : nước, methanol, acetonitril … hoặc hỗn hợp của
chúng.Các dung môi này có thể
hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký
như : độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R
s
, độ rộng của đáy pic.Nên việc
phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng .
Yêu cầu của 1 pha động :
 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

 Đánh giá chiều cao của pic với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều
cao của pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thủ từ thấp đến trung bình .
1.3.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC
Phương pháp định lượng chất phân tích trong HPLC dựa trên nguyên tắc
nồng độ của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của chất
phân tích. Cácph
ương pháp tính kết quả thường dùng
 Phương pháp chuẩn nội.
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích.
 Phương pháp chuẩn ngoại.
12 Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân
tích trong cũng một điều kiện. Nồng độ (hàm lượng)của chất chưa biết được tính
toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra từ đường chuẩn.
Trong khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa
một điểm:chuẩ
n bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử. Tiến hành song song
với nhau.Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn,
tìm được nồng độ của chất thử.
Điều kiện áp dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm: trong khoảng nồng độ
khảo sát, chứng minh luôn có tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng độ
chất phân
tích với diện tích pic của chất phân tích.[7]
1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.4.1. Yêu cầu chung
Thẩm định một phương pháp phân tích trong nguyên liệu là một quá trình
xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc trưng cơ bản của
phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích

trị thực. Do hàm lượng mẫu thử chưa được xác định chắc chắn ở thời điểm nào, vì
vậy tính đúng phải được xác định trong toàn bộ vùng cần xác định. Đối với nguyên
liệu, tính đúng được xác định trong khoảng 80% đến 120% nồng độ phân tích.
Phương pháp là đúng nếu :
 Trung bình tìm lại được từ 98% đến 102%.
 Khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1 (không có sai số hệ thống tỷ lệ).
Khoảng tin cậy của b (y=ax + b) chứa gốc tọa độ (không có sai số hằng
định).
1.4.2.3. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định chất cần phân tíchmà
không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác như tạp chất, sản phẩm phân
hủy và các thành ph
ần khác. 14

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ
- Nước cất 2 lần dùng cho HPLC
2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
- Tham khảo các phương pháp định lượng Captopril đã công bố
- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất lý hóa học của Captopril cũng như điều
kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để nghiên cứu, xây dựng quy trình định
lượngCaptopril trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC có tính chính xác, đặc
hiệu cao.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.1.Nghiên cứu các điều kiện tiến hành xây dựng phương pháp
 Khảo sát điều kiện sắc ký
Chọn bước sóng phát hiện, chọn cột, chọn pha động, tốc độ dòng thích hợp
để có pic captopril cân đối và thời gian lưu hợp lý.
Chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột Gemini C18 (250mm x 4,6mm, 5µm)
và cột Luna C8 ( 250 mm x 4,6 mm, 5µm ) là những cột thường dùng trong các cơ
sở kiểm nghiệm hiện nay. Tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương
trình sắc ký phù hợp.
 Lựa chọn dung môi để hòa tan Captopril hoàn toàn từ nguyên liệu
Dựa vào tính chất của Captopril và qua tham khảo tài liệu, bằng thực nghiệm
chọn ra dung môi thích hợp để hòa tan captopril và đảm bảo Captopril không bị
thủy phân.
2.3.2.2. Xây dựng, đánh giá phương pháp định lượng Captopril trong Captopril
nguyên liệu .
 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
 Xây dựng phương pháp định lượng
 Đánh giá phương pháp xây dựng bằng các tiêu chí
 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Captopril và diện tích
pic trên sắc ký đồ

tb
=


x
∑




(2.1)
 Độ lệch chuẩn : S =

∑











(2.2)
 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%)=




KCHƯƠ
N
1
. KHẢ
O
Qua t
h
n
h khảo sá
t
á
t hiện Ca
p
p
topril chu
ẩ
1
.1 Khảo
s
Trong
c
nhóm –C
O
ờ
i có nhóm
ớ
c sóng(λ)

n.
s
át chọn b
ư
c
ông thức
c
O
OH, nitơ
ở
carbonyl
ở
dài, Capto
p
ngắn.
à
nh quét p
h
m
l. Kết qu
ả
:
đối :
c
ậy :
Ự
C NGHI
Ệ
LUẬ
N

ả
phổ hấ
p
t
h
17

Ệ
M, KẾT
N

N
SẮC KÝ
và phân tí
c
h
òa tan và
đ
ộng, tốc
đ
h
ích hợp
a
captopril
t
1
của vòng
ứ
nhất của
m

ộ dòng tr
o
t
hì ở Carb
o
pyrolidin
c
m
ạch nhán
h
c trưng, tu
y
trong dun
g
opril được
t






x 100
%


x 




%
(2.
5
(2.
6
,
chúng tôi
như bước
s
ị
ch tự tạo
c
vòng pyro
n
tử tự do,
đ
m
ặt lý thu
y
n
cho đáp
ứ
t
an có nồn
g
ì
nh 3.1.
4
)
5