BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
:|cỉỊc:|c:l;4e4cỉ|c4e:|c:|c
LƯU THỊ GẤM
NGHIÊN CỨU DỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI AMOXICILIN
^ VÀ CLOXACÌLIN TRONG VIÊN NANG LAMLOX
BẰNG PHƯDNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NANG CAO
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001-2006)
GIÁO VIÊN HƯÓNG DẪN : THỖ. NGUYỄN THANH PHƯƠNG
THÔ. NGUYỄN TDUNG HẾU
NƠI THỰC HIỆN : PHÒNG PHÂN TÍCH n -
TDUNG TÂM KIỂM NGHIỆM DP, MP HÀ NỘI
THÒI GIAN THỰC HIỆN ; 1/2006 - 5/2006
HÀ NỘI - 2006
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới T h .s Nguyễn Thanh
Phương và T h .s Nguyễn Trung Hiếu đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện
thành công đề tài này.
Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình
của các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Phân tích II - Trung tâm Kiểm
nghiệm Dược phẩm Mỹ phẩm Hà Nội - nơi em thực hiện đề tài, cũng như
các thầy cô thuộc bộ m ôn H oá phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quỹ báu đó.
Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, thầy cô giáo
các bộ môn đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời
gian học tập vừa qua.
Em xin tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè - nhữhg người luôn động sát
cánh bên em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, tháng 05 năm 2006
SV: Lưu Thi Gấm

2.3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
21
2.3.1- Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng đồng thời
Amoxicillin và Cloxacillin bằng phương pháp HPLC 21
a. Lựa chọn pha động 21
b. Lựa chọn tốc độ dòng 23
c. Lựa chọn bước sóng để phát hiện hai chất 23
2.3.2- Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng 25
a. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý 25
b. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 26
c. Khảo sát độ lặp lại của phương p h á p 29
d. Khảo sát độ đúng của phương pháp 31
e. Khảo sát, đánh giá độ ổn định của chế phẩm với phương pháp sắc ký đã
chọn 35
2.3.3- ứng dụng định lượng chế phẩm Lamlox 37
2.3.4- Bàn luận về kết quả 39
PHẦN III - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 41
3.1- Kết luận 41
3.2- Đề xuất 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AM:
B.P;
CL:
DD:
E.P;
J.P:
HPLC:
P.C:
RP:

kháng sinh đơn thành phần trong một phác đồ điều trị đã thu được kết quả
nhất định. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, sự phối hợp này không được
khuyến khích do có thể gặp một số tương tác bất lợi [l]. Vì vậy, việc phối
hợp hai hay nhiều kháng sinh trong cùng một chế phẩm không những nới rộng
phổ, tăng hiệu quả điều trị, giảm tỷ lệ kháng thuốc mà cơ bản giúp thuận tiện
trong điểu trị [1], [2 ].
Trong những năm gần đây, ngành công nghệ bào chế đã nghiên cứu và cho
ra đời nhiều chế phẩm thuốc đa thành phần. Chế phẩm viên nang Lamlox do
công ty LYKA LABS LIMITED sản xuất là sự kết hợp của hai kháng sinh
nhóm penicilin: Amoxicilin trihydrat (tương đương với 250mg amoxicilin) và
cloxacilin natri (tương đương với 250mg cloxacilin).
Lamlox được chỉ định trong các trường hợp: Nhiễm trùng đường hô hấp do
vi khuẩn nhạy cảm; các loại nhiễm khuẩn da, mô mềm; nhiễm khuẩn huyết do
Staphylococcus, nhiễm khuẩn tiết niệu .[8 ], [12].
Trong quá trình lưu hành, một trong những khó khăn gặp phải là vấn đề
kiểm nghiệm chất lượng thuốc. Trong khi các Dược điển hiện hành [6 ], [18],
[22], [23], [25], [26] chỉ có chuyên luận kiểm nghiệm cho các chế phẩm đơn
thành phần chứa amoxicilin và cloxacilin. Bên cạnh đó, việc xác định hàm
lượng từng thành phần theo tiêu chuẩn cơ sở đôi khi khó thực hiện. Mặt khác,
nếu sử dụng phương pháp HPLC định lượng riêng từng thành phần theo một
số dược điển [18], [22], [23], [25], [26] thì tốn nhiều hoá chất, thời gian. Vì
vậy, để đảm bảo chất lượng cho mỗi lô sản phẩm cũng như tiết kiệm thòi gian,
chi phí cần phải có một phương pháp thích hợp để định lượng đồng thời hai
hoạt chất này trong cùng một chế phẩm.
Qua quá trình nghiên cứu thử nghiệm, chúng tôi quyết định lựa chọn
phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Với ưu điểm về độ nhanh,
độ nhạy, độ chính xác cao và dễ dàng triển khai tại các cơ sở kiểm nghiệm có
trang bị máy HPLC, đặc biệt trong việc định lượng chế phẩm đa thành phần,
[4], [5], [9], [11], [12], [14]. Do vậy phương pháp HPLC đang được sử dụng
rộng rãi trong kiểm nghiệm dược phẩm.

{Staphylococcus), trừ các tụ cầu tiết beta lactamase, các liên cầu
(Steptococcus), phế cầu (Pneumococcus), trực khuẩn
> Với vi khuẩn Gr(-): Amoxicilin tác dụng tốt trên các chủng vi khuẩn
hiếu khí Gr(-) như: Escherichia coli, Enterococi, Salmonella, Shigella
• Chỉ định: [2], [3], [7],
> Điều trị các nhiễm khuẩn đường hô hấp trên do các vi khuẩn nhạy cảm:
Viêm xoang, viêm tai giữa, viêm phế quản cấp và mạn tính
> Các nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng do E.coli, Enterobacter
> Các nhiễm khuẩn khác: Nhiễm khuẩn tiêu hoá, nhiễm khuẩn huyết
1.1.2. Các phương pháp định lượng amoxicilin:
• Định lượng bằng phương pháp đo thế: [3], [6 ],
- Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của amoxicilin được tính bằng cách
lấy hàm lượng phần trăm của penicilin toàn phần trừ đi hàm lượng phần trăm
của sản phẩm phân huỷ.
Penicilin toàn phần: Hoà tan chế phẩm trong dung dịch đệm boric pH 9,0
và anhydride acetic, sau đó thuỷ phân bằng kiềm và trung hoà dung dịch.
Chuẩn độ bằng thuỷ ngân (II) nitrat 0,02M, tiến hành trong đệm acetate pH
4,6. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế.
Sản phẩm phân huỷ: Hoà tan chế phẩm trong dung dịch đệm boric pH 9,0
và anhydride acetic. Chuẩn độ bằng thuỷ ngân (II) nitrat 0,02M, tiến hành
trong đệm acetate pH 4,6. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp đo thế.
Điện cưc so sánh: Điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulíat.
Điện cực chỉ thị: Điện cực platin (hoặc điện cực thuỷ ngân).
• Phương pháp đo iod (định lượng viên nang, viên nén amoxicilin): [6 ]
- Nguyên tắc: Sau khi thuỷ phân amoxicilin bằng kiềm, sản phẩm phân huỷ
của amoxicilin tác dụng với iod. Định lượng iod dư bằng natri thiosulíat
0,0IN, chỉ thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lượng. Tiến
hành song song với mẫu trắng. Kết quả tính theo phương pháp thừa trừ.
• Phương pháp đo quang phổ tử ngoại: [16]
- Nguyên tắc; Dựa trên cơ sở định luật Lambert-beer (Độ hấp thụ tỷ lệ với

254nm
l,5ml/
phút
lOịil
U.S.P28
25cm x4mm,
3-10^m(Ll)
Acetonitril: DD
KH2PO4 45% w/w
(4:96)
230nm
l,5ml/
phút
lOịil
E.p
25cmx4,6mm
5fxm (C,ịị)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,05M
pH 5,0 (1:99)
254nm
l,Oml/
phút
50^1
B.p
2005
25cmx4,6mm
5ịim (C|x)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,05M

Tên khoa học: Natri (6 R) - 6 - 3 - (2- clorophenyl) - 5- methylisoxazol- 4
- carboxamido) penicilat monohydrat. Phải chứa từ 95,0 đến 101,0%
C|9Hi7ClN3Na0 5 S theo chế phẩm khan.
• Tính chất: [2], [6 ]
- Thể chất: Bột kết tinh trắng, hoặc gần trắng,có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm.
- Độ tan; Dễ tan trong nước, methanol. Tan trong ethnol. Không tan trong
ethylacetat
- pH = 5,0 - 7,0
- Góc quay cực riêng; ttp = +160 +169
- Khả năng hấp thụ quang học: Do phân tử có các dây nối đôi liên hợp
trong vòng benzen nên phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại.
• Tác dụng dược lý: [2], [7].
Cloxacilin là kháng sinh diệt khuẩn, ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn
như benzyl penicilin nhưng kháng penicilinase của Staphylococcus. Vì vậy
thuốc có hoạt tính chống Staphylococcus sinh hoặc không sinh penicilinase .
(cloxacilin không có hoạt tính với Staphylococcus aureus kháng methicilin do
vi khuẩn này có những protein gắn penicilin biến đổi). Hoạt tính với
Stretococcus pyogenes, s. pneumoniae thấp hơn benzyl penicilin. Cloxacilin
không có hiệu lực với Enterococcus.
• Chỉđịnh: [2], [3], [7],
- Dạng tiêm: Điều trị nhiễm khuẩn nặng do Staphtlococcus sinh
penicilinase như; Nhiễm khuẩn xương khớp, viêm nội tâm mạc, viêm phúc
mạc, viêm phổi, nhiễm khuẩn da-mô mềm, nhiễm khuẩn phẫu thuật
- Dạng uống: Không dùng để điều trị nhiễm khuẩn nặng, thường dùng
điều trị tiếp sau khi đã diều trị bằng tiêm.
1.2.2. Các phương pháp định lượng:
• Phương pháp chuẩn độ đo thê: [6 ], [23].
- Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của cloxacilin được tính bằng cách lấy
hàm lượng phần trăm của penicilin toàn phần trừ đi hàm lượng phần trăm của
sản phẩm phân huỷ.

Pha tĩnh
(Cột SK)
Pha động
Detector
(A)
Tốc độ
dòng
Thể tích
tiêm
u.s.p 28
25cm X 4mm,
3-10|im (Ll)
Acetonitril: DD
KH2PO4 0,02M
pH 6,8 (20:80)
225nm
l,Oml/
phút
2 0 |al
E.p
25cm X 4mm,
5ịim (C J
Acetonitril: DD
KH2PO4 2,7 g/ì
pH5,0 (25:75)
225nm
l,Oml/
phút
2 0 ^ 1
B.p

chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động (dung môi rửa giải) dưới áp
suất cao.
1.3.2. Nguyên tắc của quá trình sác ký trong cột;
Khi tiêm mẫu cần phân tích gồm hỗn hợp các chất (A+B+C) vào cột, quá
trình rửa giải các chất lần lượt được thực hiện. Kết quả là các chất được tách
ra khỏi hỗn hợp khi đi qua cột.Thời gian lưu giữ của từng chất phụ thuộc vào
> Tương tác giữa chất tan với pha tĩnh (Fi).
> Tương tác giữa chất tan với pha động (F2).
> Tương tác giữa pha tĩnh với pha động (p,).
Tổng hợp ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước khi
lực lun giữ của nó là nhỏ nhất và ngược lại. Trong đó Fi, p2 là yếu tố quyết
định, còn p3 ảnh hưởng không nhiều. Fị, p2 khác nhau tuỳ thuộc vào bản chất
của pha tĩnh, của chất cần phân tích, cũng như bản chất, thành phần, tốc độ
của pha động. Kết quả của hiệu lực lưu giữ là khác nhau đối với từng chất
1.3.3. Pha tĩnh, pha động và detector trong HPLC.
<♦ Pha tình trong HPLC (Statỉonnenary phase) : Là chất nhồi cột làm nhiệm
vụ tách sắc ký chất cần phân tích. Nó có thể là một chất rắn đã được phân chia
dưới dạng tiểu phân hoặc là một chất lỏng được bao trên bề mặt một chất
mang rắn, hoặc là một chất mang rắn đã được biến đổi bằng các liên kết hoá
học với các nhóm hữu cơ khác nhau.
❖ Pha động trong HPLC (Mobile phage) : Là dung môi rửa giải chất tan
(chất cần phân tích) ra khỏi cột để thực hiện quá trình sắc ký. Pha động có thể
là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi trộn lẫn theo tỷ lệ nhất định.
• Tương ứng với từng loại pha tĩnh (chất nhồi cột) và pha động ta có một kỹ
thuật sắc ký riêng:
- Sác ký hấp phu: Gồm sắc ký hấp phụ pha thuận, pha đảo. Trong kỹ thuật
sắc ký này, chất tan bị lưu giữ (hấp phụ) trên bề mặt pha tĩnh và bị dung môi
pha động đẩy ra (phản hấp phụ).
- Sắc ký trao đổi và tao căp ion: Cơ chế chính xảy ra trong cột tách là sự
trao đổi giữa ion trong hỗn hợp phân tích và các ion trao đổi của pha tĩnh.

quá trình rửa giải nó vẫn được detetor phát hiện và cho tín hiệu sắc đồ.
• Các đặc trưng của quá trình sắc kỷ: Pha tĩnh, pha động đều ảnh hưởng
đến kết quả của sự tách sắc ký;
- Độ phân giải của hai pic kề nhau.
- Thời gian lưu giữ của chất tan.
- Sự cân xứng pic.
- Độ rộng của pic sắc đồ
1.3.4. Hệ thống máy HPLC:
x>í*tííi
TSẼSTÌ
Ü
Waste
c ollector
ỂI©-w s aacsiia;:»
A .U to
M P IL C ; C
i aa Oní-eEt
Hình 1.1- Sơ đồ chung cho các máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đại
11
1- Bình chứa dung môi gắn với bơm cao áp 2- Hệ thống xử lý mẫu tự động
3- Hệ tiêm mẫu 5- Bộ phận ghi sắc đồ
4- Detecter 6 - Máy vi tính
1.3.5- Các đại lượng đặc trưng;
<♦ Thời gian lưu (Retention time - tp): Là khoảng thời gian cần thiết để
một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu, qua cột sắc ký, tới khi xuất hiện đỉnh của
pic. Biểu thức tính thời gian lưu hiệu chỉnh: t’R = tR-t() (1.1)
Trong đó:
- 1(|: Là thòi gian chết (thời gian lưu của chất không bị lun giữ): nghĩa là tốc
độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của phân tử dung môi.
- t^: Là thời gian lưu của chất cần phân tích, ír càng lớn thì tốc độ di

k’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc:
_ í 'r .b
^ = ^ = (1.4)
^ B ^ R,A
Ý nghĩa: a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký (quy ước chất B bị
lưu giữ mạnh hơn chất A), vì vậy a >1. Để tách riêng hai chất ta thường chọn
các điều kiện sắc ký sao cho l,05<a<2,00.
Nếu a quá bé thì khả năng tách của hai chất khỏi nhau kém. Nếu a lớn thì
hai chất tách khỏi nhau tốt, song nếu a quá lớn thời gian phân tích kéo dài.
❖ Hê số bất đối AF: Là thông số để đánh giá tính thích hợp của phương pháp
sắc ký. Biểu thức tính AF; AF - — (1 .5 )
Trong đó: b; Là chiều rộng phía sau của pic đo ở 1/10 chiều cao pic.
a: Là chiều rộng phía trước của pic đo ở 1/10 chiều cao pic
Một chất nhồi cột tốt sẽ có AF trong khoảng 0,9 ^1,1.
❖ Số đĩa lý thuyết (N) và chiéu cao của đĩa (H):
13
Công thức tính: N = 16;
w
= 5,54x
w
(1.6)
N
(1.7)
Trong đó: W: Là chiều rộng đo ở đáy pic
Wi/2: Là chiều rộng đo ở 1/2 chiều cao của pic.
L: Là chiều cao của cột sắc ký.
Ý nghĩa: N, H phản ánh hiệu lực tách của cột. Cột có N càng lớn, H càng
nhỏ là cột có hiệu lực cao. Trong quá trình sử dụng, N phải được đánh giá lại.
*1* Đổ phân giải giữa hai pic liền ké nhau (Rc):
Là đại lượng biểu thị mức độ tách hai chất khỏi nhau trong cùng một điều

Phương pháp này dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả các pic
bị trôi đường nền. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của pic
được nhận ra chính xác. Việc đánh giá diện tích pic cho kết quả chính xác và
được áp dụng phổ biến trong định lượng với nồng độ chất phân tích thấp,
trung bình, hoặc cao.
❖ Đánh giá chiéu cao pic:
Điều kiện để áp dụng cho việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số K’
hằng định. Với các pic có đường nền bị nhiễu hoặc pic hẹp thì xác định chiều
cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn xác định diện tích pic.
1.3.7- Các kỹ thuật định lượng trong phương pháp HPLC: [4], [5], [9],
[12].
Nguyên tắc: Nồng độ của chất cần phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện
tích của chất đó. Dựa trên nguyên tắc này, ta có các kỹ thuật định lượng;
> Phươn2 vháv chuẩn nsoai: Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh
diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn và mẫu thử được phân tích trong
cùng điều kiện sắc ký. Chất chuẩn ngoại là chất phân tích tinh khiết đã biết
hàm lượng và đạt yêu cầu của chất chuẩn theo quy định.
- Chuẩn hoá một điểm (so sánh trực tiếp).
- Chuẩn hoá nhiều điểm (xác định khoảng tuyến tính).
> Phươỉi2 vháv chuẩn nôi:
15
Nguyên tắc: Là phương pháp thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng
chất chuẩn không đổi. Chất chuẩn thứ hai này được gọi là chất chuẩn nội và
thường có cấu trúc, tính chất gần giống chất cần phân tích.
Tương tự ta có phương pháp chuẩn hoá một điểm và chuẩn hoá nhiều điểm.
> Phươns pháp thêm chuẩn:
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề
ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ như các loại tá dược), hoặc khi xác định tỷ
lệ tìm lại (xác định độ đúng). Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác
định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và chuẩn

- Máy lắc siêu âm Bransonic.
- Máy đo pH Metrohm
- Bộ lọc mẫu Satorious với màng lọc 0,45Ịim.
- Cân phân tích Metler chính xác ± 0,lmg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong
2.1.3- Phương pháp nghiên cứu
a. Nội dung:
> Khảo sát và xây dựng chương trình sắc ký định lượng đồng thời
amoxicilin và cloxacỉlin trong chế phẩm hỗn hợp:
- Lựa chọn cột sắc ký.
- Lựa chọn pha động.
- Lựa chọn bước sóng đo (detector ƯV-VIS).
- Lựa chọn tốc độ dòng.
- Lựa chọn thể tích tiêm mẫu.
> Đánh giá phương pháp:
- Xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Xác định khoảng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích.
- Xác định độ lặp lại của phương pháp.
- Xác định độ đúng của phương pháp.
- Khảo sát độ ổn định của amoxicilin và aloxacilin trong dung môi pha
động bằng phương pháp HPLC
> ứng dụng phương pháp trên để định lượng chế phẩm Lamlox.
b. Phưong pháp nghiên cứu
- Bằng thực nghiệm kết hợp với tài liệu tham khảo tiến hành xây dựng qui
trình định lượng hỗn hợp amoxicilin và cloxacilin bằng phương pháp
HPLC.
- Thu thập số liệu và sử lý thống kê để đánh giá kết quả.
2.1.4- Các đại lượng thống kê để xử lý kết quả thực nghiệm:
- Giá tri trung bình: X =(21)
n ,^|

• Định tính:
Do thời gian lun đặc trưng cho từng chất, nên thời gian lưu của từng chất
trong mẫu thử phải giống với thời gian lưu của từng chất tương ứng trong mẫu
chuẩn trên sắc ký đồ thu được trong cùng điều kiện sắc ký ở phần định lượng.
• Định lượng
Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau:
- Tính hàm lượng (mg/viên) của từng chất theo công thức:
19
X(mg/viên) = (2.11)
- Tính hàm lượng phần trăm của từng chất trong chế phẩm theo công thức;
s. X xC(l-H)xn. X mxiooo
P(%) = , 1 0 0 (2.12)
X X h X
Trong đó:
s, ,s^. : Diện tích hoặc chiều cao của mẫu thử, mẫu chuẩn
m^.: Lượng chuẩn đã cân của từng chất (mg).
: Khối lượng trung bình của 20 viên (g).
m,: Khối lượng bột viên chất thử (g).
c : Hàm lượng phần trăm chuẩn tương ứng trên nhãn (%).
H : Hàm ẩm của chất chuẩn ghi trên nhãn (%).
iit: Độ pha loãng của dung dịch thử.
n^.: Độ pha loãng của dung dịch chuẩn.
h: Hàm lượng amoxicilin (cloxacilin) của chế phẩm Lamlox (mg).
20