BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LƯƠNG THỊ PHẤN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯƠNG THỊ PHẤN
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG
HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS.Nguyễn Tiến Vững
2. TS.Nguyễn Thị Thuận

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………
1

Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………
3

1.1. Hợp chất strychnin……………………………………………………… 3

1.1.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 3

1.1.2. Tính chất……………………………………………………………… 3

1.1.3. Dược động học…………………………………………………………. 3

1.1.4. Tác dụng……………………………………………………………… 4

1.2. Hợp chất brucin……………………………………………………………

4

1.2.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 4

1.2.2. Tính chất……………………………………………………………… 4


1.5.5. Ứng dụng của phương pháp HPLC……………………… 11

1.6. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương………………………………. 12

1.6.1. Tủa protein…………………………………………………………… 12

1.6.2. Chiết lỏng- lỏng…………………………………………… 12

1.6.3. Chiết pha rắn……………………………………………… 13

1.7. Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………. 13

1.7.1. Tính thích hợp hệ thống……………………………………………… 13

1.7.2. Độ chọn lọc…………………………………………………………… 13

1.7.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính………………………………… 13

1.7.4. Giới hạn định lượng dưới…………………………………………… 14

1.7.5. Độ đúng…………………………………………………… 14

1.7.6. Độ chính xác…………………………………………………………… 14

1.7.7. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 14

1.7.8. Độ ổn định…………………………………………………

14

tương bằng HPLC…………………………………
23

3.1.1. Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp 23

3.1.2. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương……… 26

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích……………………………………… 28

3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống…………………………………………… 28

3.2.2. Độ đặc hiệu- chọn lọc………………………………………………… 29

3.2.3. Đường chuẩn- khoảng tuyến tính…………………………………… 31

3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……………………………………. 33

3.2.5. Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày…………………… 34

3.2.6. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 37

3.2.7. Độ ổn định của mẫu huyết tương………………………… 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………

42

1. Kết luận……………………………………………………………………… 42

2. Kiến nghị………………………………………………………………… 42

HPLC/DAD

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector diod array (High Performance
Liquid Chromatography/Diode Array Detection).
HPLC/MS

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector khối phổ (High Performance
Liquid Chromatography/Mass Spectrometry).
HPLC/UV

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector UV ((High Performance
Liquid Chromatography/Ultraviolet).
HQC

: Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High quality control).

HT

: Huyết tương
IS

: Chất chuẩn nội (Internal standard).
LC/MS

: Sắc ký lỏng/ detector khối phổ (Liquid Chromatography/Mass
Spectrometry).
LLOQ

: Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification).


: Sắc ký đồ

ST

: Strychnin

ULOQ

: Giới hạn định lượng trên (Upper Limit of Quantification).

UPLC

: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid
Chromatography).
DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên Bảng
Trang

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết IS (900ng/ml)
37
Bảng 3.7a: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ST
38
Bảng 3.7b: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết BR
39 Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ
đông-rã
39
Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu HT thời gian ngắn
40
Bảng 3.10: Kết quả ổn định mẫu huyết tương thời gian dài
41

ST trong HT và tỷ lệ diện tích pic ST/IS.
31
Hình 3.12b: Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ
BR trong HT và tỷ lệ diện tích pic BR/IS.
32
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Mã tiền (Semen Strychni) là một vị thuốc quý được sử dụng từ lâu trong cả đông
y và tây y. Vị thuốc này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như: Dược
điển Trung Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980… Mã tiền được
chế từ hạt chín phơi hay sấy khô của cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica).
Vị thuốc này đã được y học dân gian Trung Quốc sử dụng hiệu quả trong giảm
bớt tình trạng viêm, đau khớp, triệu chứng dị ứng và điều trị các bệnh thần kinh. Tuy
nhiên do độc tính của hạt rất cao nên không được phép sử dụng trực tiếp mà phải qua
chế biến. Alcaloid được biết đến là thành phần thể hiện hoạt tính sinh học của loài cây
này, trong đó strychnin và brucin là hai alcaloid có nhiều nhất trong hạt mã tiền và có
ảnh hưởng quan trọng đến tác dụng cũng như độc tính của hạt. Một mặt, Strychnin và
brucin có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư, nhưng bên cạnh đó chúng có
thể dẫn tới các rối loại vận động, tăng trương lực cơ, tăng hoạt động cảm giác, ở liều
cao có thể gây co giật hệ thống thần kinh trung ương và dẫn đến tử vong do liệt hô hấp,
liệt cột sống hoặc ngừng tim. Ngoài ra, strychnin còn được sử dụng làm thuốc diệt
chuột và một số loài động vật gặm nhấm. Nó cũng được biết đến là một trong những
chất đầu tiên được sử dụng để nâng cao hiệu suất trong thể thao. Strychnin tác dụng
chọn lọc và đối kháng cạnh tranh với glycin trên receptor glycin ở tủy sống. Liều cao
tác động cả lên receptor glycin ở não. Ngộ độc strychnin có thể gây tử vong cho người
và động vật. [12][30][23] 3

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. Hợp chất strychnin
1.1.1 Công thức cấu tạo

Công thức phân tử: C
21
H
22
N
2
O
2
Phân tử lượng: 334,41
Tên khoa học: (4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR)-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15b,16-
decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-h]quinoline-
14-one.
1.1.2. Tính chất
Là tinh thể không màu hoặc màu trắng, không mùi, vị rất đắng. Nhiệt độ nóng
chảy: 270°C. Khối lượng riêng 1,36 g/cm
3
. PH của dung dịch bão hòa: 9,5.
Độ tan trong: nước là 1/6400 (g/ml), nước sôi là 1/3100 (g/ml), rượu là 1/150
(g/ml), chloroform là 1/35 (g/ml), benzen là 1/180 (g/ml), toluen là 1/200 (g/ml),
methanol là 1/260 (g/ml), glycerol là 1/320 (g/ml), rất ít tan trong ether. [33][39][28]

h]quinoline-14-one.

1.2.2. Tính chất
Tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi, vị cay đắng. pH của dung dịch nước bão
hòa 9,5. Nhiệt độ nóng chảy: Dạng khan: 178°C; dạng hydrat: 105°C.
Độ tan: Trong methanol 1/0,8 (g/ml); trong chloroform 1/5 (g/ml), trong ethyl
acetate 1/25 (g/ml); trong glycerol 1/36 (g/ml); trong ether 1/187 (g/ml); trong nước
1/1320 (g/ml); trong nước sôi 1/750 (g/ml).[29]
1.2.3 Dược động học
5

Thí nghiệm trên chuột cho thấy: sau khi uống brucin được hấp thu nhanh (T
max

< 0,5h). Sự gia tăng AUC cho thấy tỷ lệ thuận với sự gia tăng liều. Sinh khả dụng
đường uống (F) không thay đổi theo liều. Giá trị C
max
được tính toán là 0,73±0,23
µg/ml.[16][17][27]
1.2.4. Tác dụng
Brucin có tác dụng tương tự strychnin nhưng yếu hơn. Nó gây liệt dây thần
kinh ngoại biên và tạo ra cơn co giật dữ dội. Brucin có thể gây buồn nôn, nôn, phấn
khích, co giật và co giật với liều lượng lớn. Ngoài ra brucin còn có tác dụng giảm đau,
chống viêm và chống ung thư. [29][40]
1.3. Nguồn gốc của strychnin và brucin
Strychnin và brucin là hai thành phần alcaloid trong hạt Mã tiền có độc tính và
tác dụng sinh học mạnh.
* Một số đặc điểm của cây Mã tiền
1.3.1. Tên khoa học
Strychnos nux-vomica L.

-Pha động: acetonitril trong đệm
phosphat 20 mM pH 3,8
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 358°C
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
- Thể tích tiêm: 100 µl
-Chất chuẩn nội: Chloroquin
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng
2 32 Dịch
chiết từ
côn trùng

HPLC/
MS
Phenomenex
Luna C18 (150
mm×2,0 mm,
5µm)
-Pha động: MeOH 10% : acid
acetic 90%
-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
-Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
-Thể tích tiêm: 10µl
3 43 Bột dược
liệu
HPLC-
ESI/MS
Zorbax Bonus

-Chất chuẩn nội: tacrin
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng.
5 15 Mô
chuột
HPLC-
UV
Kromasil C18
(250 mm×4,6
mm, 5µm)
-Pha động: 24% acetonitril- 76%
đệm (hỗn hợp đẳng cực của 0,01
mol/l natri sulfonat heptan và 0,02
mol/l kali dihydrogen phosphat giá
trị pH 2,8 bằng acid phosphoric 10
%)
-Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
-Nhiệt độ cột: 35°C
-Bước sóng phát hiện: 264 nm
-Chuất chuẩn nội: hyperzin A
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết
lỏng-lỏng.
-Thể tích tiêm: 20µl
6 41 Huyết
tương
chuột
UPLC-
MS/MS
BEH C18 (50
mm×2,1 mm

-Khí mang: Helium (1ml/phút)
-Nhiệt độ phun: 250°C
-Nhiệt độ giao diện MS: 280°C
-Nhiệt độ lò: 170°C
MSD
-Chế độ ion hóa: EI (70ev)
-Nhân điện tử: 2000 V
9 30 Máu và
nước tiểu

HPLC-
ESI-MRM
XBridge
TM

Shield RP 18
(250 mm×3,0
mm i.d, 5µm)
-Pha động: acetonitril và amoni
bicarbonat 10mmol/l (dung dịch
nước ammoniac được dùng để điều
chỉnh pH 10,5).
-Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
-Nhiệt độ: 35°C
-Bước sóng phát hiện: 235 nm
-Thể tích tiêm: 10µl
-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha
rắn.
10 38 Máu RP- HPLC


-Phương pháp xử lý mẫu: chiết pha
rắn.
12 18 Máu,
nước tiểu

HPLC-
ESI-
MS/MS
BDS
HYPERSIL
C18
(150mm×2,1m
m , 2,4 µm)
-Pha động: 10 mmol/l amoni format
trong nước với acid formic 0,1%.
-Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút
-Nhiệt độ: 40°C
Nhận xét: Phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương
bằng GC/MS, UPLC-MS, HPLC-ESI, LC-ESI-MS, khá phức tạp, tốn kém và chưa phù
hợp với đa số phòng thí nghiệm ở Việt Nam. Vì vây, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu
xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng
HPLC/UV đơn giản, có độ đúng, chính xác cao và kinh tế, phù hợp với điều kiện các
phòng thí nghiệm của Việt Nam hiện nay.
1.5. Phương pháp HPLC
1.5.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao
10

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích sắc ký dựa trên sự phân chia
khác nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là
chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. Sắc ký


Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều
thành phần. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ và đường kính
cỡ hạt từ 3-10 µm.
Yêu cầu của pha tĩnh: phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký, có khả năng
tách trong điều kiện nhất định, tính chất bề mặt ổn định, cân bằng động học của sự tách
phải xảy ra nhanh và chính xác tốt, cỡ hạt phải đồng nhất.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO
2
), nền oxyd nhôm (Al
2
O
3
),
nền hợp chất cao phân tử (cellulose) Pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu điểm và
được sử dụng nhiều nhất.
1.5.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột tách để
thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc
ký của một hỗn hợp. Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi
theo tỷ lệ nhất định.
Yêu cầu: phải trơ đối với pha tĩnh, phải hòa tan được chất mẫu, ổn định theo
thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
1.5.4.3. Chọn hệ đệm
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính
acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc
ký và làm tăng hiệu lực tách. Thông thường với các chất tan là acid hữu cơ thì phải
dùng đệm pH acid nhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ, còn sắc ký tạo cặp ion
thì pH tùy từng trường hợp.
1.5.4.4. Tốc độ dòng

2+
…[3].
1.6.2. Chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction)
Chiết lỏng-lỏng là phương pháp tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của
chất tan trong hai chất lỏng không thể hòa trộn vào nhau, thường là nước và một dung
13

môi hữu cơ. Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết lỏng-lỏng, có thể sử dụng các
thông số sau:
 Hệ số phân bố
 Hệ số tách
 Hệ số khử tạp [3]
1.6.3. Chiết pha rắn (solid – phase extraction)
Chiết pha rắn là phương pháp tách các chất dựa vào ái lực của chất tan với pha
động khi cho pha động chạy qua pha tĩnh. Pha tĩnh trong chiết pha rắn thường gồm
silica gắn với một nhóm chức đặc biệt. [3]
Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp chiết như
trên.Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không
kinh tế nên chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein và chiết lỏng-lỏng
để xử lý mẫu huyết tương.
1.7. Thẩm định phương pháp định lượng
1.7.1. Tính thích hợp hệ thống
Đánh giá tính thích hợp hệ thống là những phép thử nhằm đánh giá tính tương
thích của toàn hệ thống phân tích được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị,
hệ thống điện, cách tiến hành phân tích và mẫu thử. [36][21]
1.7.2. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định
tính-định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có
trong mẫu.[8]
1.7.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính