BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ĩỉí;ỉ< :ỉíĩíí^ĩỉí;ỉí:íí> fí:íí:íí; ỉí: í:;íc ;ỉí; fí:íí> !í^* ;ỉí/^
NGÔ THANH THƯỶ
NGHIÊN CỨU DỊNH LƯỢNG DỒNG THỜI CLOTRIMAZOL VÀ
METRONIDAZOL TRONG VIÊN ĐẶT APHANETEN
BẰNG PHƯ0NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001 - 2005)
Người hướng dẫn: PGS.TS THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS THÁI DUY THÌN
Nơi thực hiện: PHÒNG HOÁ LÝ I - VIỆN KIỂM n g h iệ m
Thời gian thực hiện: 8/2004 ĐÊN 5/2005
HÀ NÔI 5 - 2005 \ ^
Ị
■ V'.' 1^ ' "■ >
y f l w
Nó''Oc^
LỜI CÁM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý I - Viện
Kiểm nghiệm Bộ Y tế và Bộ môn Hoá dược - Trường đại học Dược - Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp
đỡ tận tình của các thầy, cô hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn Hoá dược
và các cán bộ của phòng Hoá lý I Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế.
Tôi xin chân thành cám ơn sự hưófng dẫn chỉ bảo tận tình của;
- Tiến sĩ: Thái Duy Thìn - Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược - Trường đại
học Dược - Hà Nội
- Phó giáo sư - Tiến sĩ; Thái Phan Quỳnh Như - Trưởng phòng Hoá lý I -
Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế
Đã giúp đỡ tôi những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực
hành khóa luận.
Tôi xin cám ơn sự giũp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật viên trong

1.4.3-Hệ thống HPLC 12
1.4.4- Pha tính trong HPLC 13
1.4.5- Pha động trong HPLC

1.4.6- Cách đánh giá pic 17
1.4.7- Cách tính kết quả
1 ^
PHẦN 2- NGUYÊN LIỆU, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

.
19
2 .1- Đối tượng nghiên cứu 19
2.2- Thiết bị và hoá chất
19
2.2.1- Hoá chất 19
2.2.2- Thiết bị, dụng c ụ 19
2.3- Nội dung, phương pháp nghiên cứu
20
2 .3 .1- Nội dung 20
2.3.2- Phương pháp nghiên cứu
20
2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích 20
2.3.4- Cách đánh giá kết quả 21
PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
22
3.1- Xây dựng điều kiện sác ký để định lượng đồng thời clotrimazol và
metronidazol 22
3.1.1- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc k ý
26

Xí nghiệp Dược phẩm 120 có sản xuất viên nén đặt phụ khoa ở dạng phối
hợp với tên “Aphaneten”.
Khi sản phẩm này ra đời thì vấn đề đặt ra ở đây là phải kiểm tra chất
lượng thành phẩm trước khi thuốc đến tay người dùng. Mặt khác trong các
Dược điển hiện hành [5], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21] chỉ có chuyên
luận viên đơn thành phần chứa clotrimazol hoặc metronidazol, vì vậy để kiểm
tra chất lượng sản phẩm cần nghiên cứu phương pháp định tính và định lượng
hai hợp chất này trong cùng một dạng bào chế.
Ngày nay khoa học kỹ thuật đã phát triển vượt bậc, đã có nhiều thành tựu
được đưa vào ứng dụng và đã mang lại cho chúng ta những phương pháp kiểm
nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một trong những phương pháp đó là sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định
lượng có kết quả, các hợp chất trong nhiều loại thuốc đa thành phần [8 ], [13],
[14],
Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định lượng đồng thời các hoạt
chất trong viên thuốc đặt phụ khoa “Aphaneten” bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với mục tiêu cụ thể sau:
- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời clotrimazol và
metronidazol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành
Dược một phương pháp kiểm nghiệm ngoài Dược điển nhằm mục đích rút
ngắn thời gian tiến hành định lượng, tăng độ chọn lọc và nâng cao hiệu quả
phân tích.
- Góp phần xây dựng tiêu chuẩn để tiêu chuẩn hoá thuốc mới trước khi
đưa ra thị trường.
- Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để kiểm nghiệm nhanh và chính
xác một số thuốc có thành phần tưcmg tự như trên đang lưu hành trên thị
trường.
PHẦN 1 - TỔNG QUAN
1.1- CLOTRIMAZOL

Tốc độ dòng: l,5ml/phút
Thể tích tiêm: 20|Lil
1.1.3- Tác dụng dược lý: [2]; [6]
* rác dụng:
Clotrimazol là thuốc kháng nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều loại nấm
gây bệnh, gồm các loại nấm trên bề mặt da, niêm mạc và nấm nội tạng. Ngoài
ra thuốc còn có tác dụng trên vi khuẩn gram (+).
* Cơ chế tác dụng:
Clotrimazol có tác dụng ức chế alphademethylase (enzym tham gia vào
quá trình tổng hợp ergosterol) do đó clotrimazol ngăn cản tổng hợp ergosterol
và lipid của màng tế bào nấm. Kết quả là làm thay đổi tính thấm của màng tế
bào, ức chế chức năng màng và ức chế sự phát triển của nấm. Liều thấp thuốc
có tác dùng kìm nấm, liều cao thì diệt nấm.
1. 2- METRONIDAZOL
1.2.1- Đại cưong: Ị 1 ]; [ 5 ]
* Công thức:
O2N'
C6H9N3O:
CH2 -C H 2 -O H
^ N ^ C H 3
— N
Rl: 171,16
* Tên khác: Flagyl; Klion; Protostat; Metro IV; Novomidazol trikacide.
* Tên khoa học: 1 - (P - hydroxyetyl) - 2 - metyl - 5 - nitroimidazol
* Tính chất:
Tinh thể hay bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vững bền ngoài
không khí, song sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng.
Khó tan trong nước, aceton, dicloromethan và ethanol 96%, rất khó tan
trong ether.
1.2.2- Các phương pháp định lượng:

và thể mạn. Với lỵ amip mạn ở ruột, thuốc có tác dụng yếu hơn do ít xâm
nhập vào đại tràng.
Ngoài ra thuốc còn có tác dụng tốt đối với trichomonas vaginalis, giardia,
các vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn gram (-), kể cả barteroid, clostridium,
helicobacter, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn ưa khí.
* Cơ chê tác dụng:
Nhóm nitro của metronidazol bị khử bởi protein vận chuyển electron
hoặc bởi ferredoxiri. Metronidazol dạng khử làm mất cấu trúc xoắn của ADN,
tiêu diệt vi khuẩn và sinh vật đơn bào.
1.3- CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CLOTRIMAZOL,
METRONIZOL TRONG CHẾ PHẨM HỖN h ợ p
* Định lượng thuốc đạn clotrimazol, metronidazol và chlohexidine
acetat:
1.3.1 - Định lượng clotrimazol: [19]
Cân 10 viên thuốc đạn, hơ nóng cho chảy rồi trộn đều và để nguội. Cân
chính xác một lượng thuốc đạn (đã chảy lỏng và để nguội ở trên) tương đương
với khoảng 400mg clotrimazol. Thêm 20ml cloroform ấm hoà tan lượng thuốc
đạn trên trong một phễu chiết và lắc đều cho tan hoàn toàn sau đó làm lạnh
đến nhiệt độ phòng. Chiết metronidazol và chlohexidine acetat từ dung dịch
trên 3 lần (40, 20, 20ml) bằng dung dịch acid acetic (1,5M), lọc dịch chiết vào
một bình định mức lOOml, rửa giấy lọc bằng dung dịch acid acetic (1,5M),
gộp dịch rửa và dịch chiết rồi thêm acid acetic (1,5M) đến vạch và trộn đều.
Lọc phần cloroform, rửa phễu chiết và giấy lọc bằng cloroform, gộp dịch
rửa và dịch chiết clorform và dồn vào bình định lượng. Thêm lOml dung dịch
acid acetic, 2 ml dung dịch anhydric acetic, 2 giọt tím tinh thể và định lượng
bằng acid pecloric (0,1M) cho đến khi chuyển sang màu xanh sẫm. Song song
tiến hành làm mẫu trắng.
1.3.2 - Định lượng metronidazol:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng lOOmg metronidazol
chuẩn rồi hoà tan bằng methanol trong bình định mức lOOml. Thêm methanol

tính chất. Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột, được nhận biết bởi bộ
phận phát hiện gọi là detector. Tuỳ theo bản chất của các chất phân tích mà sử
dụng detector thích hợp. Detector hay được sử dụng nhất là detector uv. Sau
một qúa trình sắc ký ta thu được một sắc ký đồ, sắc ký đồ phản ánh quá trình
tách sắc ký ở trong cột tốt hay không. Trong quá trình sắc ký chất nào được
lưu giữ mạnh nhất trong pha tĩnh sẽ được pha động rửa giải ra khỏi cột sau
cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên. Thời gian
chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh
cũng như tính chất hoá lý của chất tan.
1.4.2- Các đại lượng đặc trưng:
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và
ghi thành sắc ký đồ.
signal
Component 1
Component 2
Hình 1.1: Các đại lượng đặc trưng trên sắc ký đồ
trong phép định lượng bằng HPLC.
*t* Thời 2Ìan lưu t¡i (phút) (Retention time):
Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh
của pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất). So sánh thời gian lưu của mẫu
thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó.
+ Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động
Ír ~ ^0 (dung dịch) ( 1 + K ) (1)
Trong một phép phân tích nếu ír nhỏ quá thì sự tách kém, còn Ir quá
lớn (Ir > 2 0 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài.
Để thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố

chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ơ mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H. Ta có
thể tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:
(5)
Trong đó: Chiều rộng pic ở đáy pic
W|^2- Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh
2
N= 16
= 5,54
w
_ B _
w
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý ihuyêt
được tính bằng công thức:
L
H =
N
(6)
❖ Đô phân siải (Rs):
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký đã cho:
t„ o - t .
Rs =
-R.B -R.A _ Khoảng cách giữa hai pic
1/ r +\Y 1 Đô rông trung bình của hai pic
/ 0 1 B A J
❖ Hê sô đôi xứns (T):
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức;
T =

pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion.
- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có hai kiểu
xốp: Xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
* Điều kiện đối với một pha tĩnh :
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong diều
kiện sắc ký nhất định
- Tính chất bề mặt phải ổn định
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
* Chế tạo pha ãnh. Pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
- Pha tĩnh trên nền silicagel
- Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm
- Pha tĩnh trên nền mạch carbon
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền silicagel là ưu việt hơn và được
sử dụng nhiều nhất.
* Pha tĩnh trên nền silicagel:
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký pha thuận. Loại này trên bề mặt
của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động có tính chất phân
cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực
và ít phân cực. Pha động của loại này là những chất không phân cực hoặc ít
phân cực. Với loại pha tĩnh này, nước có ảnh hưởng nhiều đến bề mặt hoạt
động của chúng (tức là các nhóm -OH ái nước). Chính yếu tố này làm ảnh
hưởng đến độ lặp lại của quá trình tách sắc ký.
- Silicagel đã alkyl hoá: Được sử dụng cho sắc ký pha đảo. Nhóm -OH
của silicagel trung tính được alkyl hoá bằng các gốc alkyl của mạch carbon
thẳng hay các gốc carbon vòng như nhân phenyl.ơiính vì bị thế mất nhóm
-OH nên bề mặt của chất nhồi loại này không phân cực hay ít phân cực. Loại
chất nhồi cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất
phân cực và có thể cả cho sắc ký cặp ion. Pha động cho loại này là chất hữu cơ

chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu
quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất tách
sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và
hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể ảnh hưởng đến:
- Độ chọn lọc của hệ pha
- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực của cột tách
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh
- Độ rộng của pic sắc ký
• Trong HPLC pha động phải thoả mãn một sô điều kiện sau :
- Trơ đối với pha tĩnh
- Hoà tan được chất cần phân tích
- Bền vững theo thời gian
- Có độ tinh khiết cao
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
- Phù hợp với loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân
tích
- Có tính kinh tế, dễ kiếm
• Trong sắc ký pha thuận :
Pha động phải là các dung môi hữu cơ không phân cực hoặc ít phân cực
như n-hexan, n-heptan, cloroform, tetraclorcarbon Trong quá trình chạy sắc
ký, để cho quá trình tách được ổn định độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động
trước khi chạy sắc ký bằng nước.
• Trong sắc ký pha đảo :
Pha động là hệ dung môi phân cực, là những dung môi đồng tan với nước,
có khi nước lại là thành phần chính trong pha động ví dụ như methanol,
acetonitril Ta có thể tạo ra những pha động có độ phân cực khác nhau bằng
cách thêm vào đó những tỷ lệ nước nhất định, do đó hệ pha này trở nên linh
động và được ứng dụng nhiều. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, thành phần

pic sẽ dễ dàng hơn và chính xác hơii việc xác định diện tích pic.
I a /C ' ^ ' \
j Ahĩó^.
1.4.7- Cách tính kết quả:
* Phương pháp ngoại chuẩn :
Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử được phân
tích trong cùng điều kiện. Kếl quả của chất chưa biết được tính toán so với
mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn.
* Phương pháp nội chuẩn:
Là phươrig pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất
không đổi, mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần thời gian
lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử. Nó được tách hoàn toàn và có nồng
độ gần bằng nồng độ của chất phân tích và có cấu trúc hoá học tưoỉng ứng.
* Phương pháp thêm:
Chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của
các chất phụ (ví dụ: Tá dược). Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác
định chất chuẩn. Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử
thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện sắc ký.
1.4.8- Nhận xét:
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được ứng dụng rộng rãi trong
việc định lượng các thuốc đơn thành phần cũng như đa thành phần. Phương
pháp này có độ chính xác và độ nhạy cao, tốn ít mẫu, có tính đặc hiệu, thực
hiện tương đối nhanh và thuận tiện, đặc biệt là định lượng đồng thời được các
thành phần trong hỗn hợp mà không qua quá trình chiết tách, có thể thực hiện
được ở những cơ sở kiểm nghiệm đã được trang bị máy HPLC.
Với những ưu điểm của phương pháp HPLC và những nhược điểm của
các phương pháp khác trong việc định lượng thuốc đa thành phần như đã nêu ở
mục 1.3. Chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu định tính và định lượng đồng thời
clotrimazol và metrimazol bằng phương pháp HPLC.
PHẦN 2

* Khảo sát các điều kiện sắc ký:
Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng đồng thời
clotrimazol và metronidazol trong thuốc hỗn hợp bao gồm;
- Chọn cột sắc ký
- Chọn pha động (thành phần, tỷ lệ)
- Detector UV, chọn bước sóng đo
- Tốc độ dòng
- Thể tích tiêm
- Cách xử lý mẫu
*- Đánh giá phương pháp:
- Tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Xác định độ tuyên tính giữa nồng độ và diện tích pic
- Xác định độ chính xác và độ đúng của phương pháp
-Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
2.3.2- Phương pháp nghiên cứu:
- Phương pháp thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách 2
chất được tốt nhất, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả
- Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
2.3.3- Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích:
- Giá tri Trung bình: x=^.Vx. (10)
n t t