BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
c«ỉo
ĐÀO THỊ THANH NHÀN
ĐỊNH LƯỢNG ĐÒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ
SPIRAMYCIN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUANG PHỎ ƯV-VIS
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)
Người hướng dẫn : TS. THÁI DUY THÌN
NCS. TRẦN VIỆT HÙNG
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện : 02/2006 đến 05/2006
Hà Nội, 05/2006
y y !■" ■
.

?■ ", ■ ■ g g ít :
T 1 i
Lòi cảm ơn
Để hoàn thành được khoá luận tốt nghiệp nàỵ, trước tiên tôi xin bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói:
Tỗ. Thái Duỵ Thìn
NCỒ. Trần Việt Hùng
Những ngưòi đã hướng dẫn tôi tận tình trong suốt thòi gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và kỹ thuật viên bộ môn
Hoá Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đõ tôi trong thòi gian tôi lảm
thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin gửi tói toàn thể giảng viên, cán bộ Trưòng Đại ĩìọc Dược
ỉlả Nội lòi cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt dạỵ bảo trong suốt năm năm tôi
học tập tại đâỵ.
Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn tối cha mẹ, bạn

1.2.2. Các kỹ thuật định lưọng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis. 14
1.2.3. ưu, nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang phổ
UV-Vis 19
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21
2.1. Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu
21
2.1.1. Nội dung nghiên cứu 21
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 21
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2. Thuốc thử, hoá chất, dụng cụ 25
2.3. Xây dựng phưotig pháp định lượng đồng thời Metronidazol và
Spiramycin trong viên nén bằng phương pháp quang phổ UV-Vis 26
2.3.1. Khảo sát phổ hấp thụ u v và lựa chọn các bước sóng phân tích 26
2.3.2. Khảo sát tính tuyến tính và tính cộng phổ ở các bước sóng phân
tích của dung dịch hỗn hợp 2 chất Metronidazol và Spiramycin 28
2.3.3. Phân tích chế phẩm Rodogyl 30
2.3.4. Đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp

33
2.4. So sánh gía trị trung bình và độ lặp lại giữa phương pháp mới xây
dựng và phương pháp định lượng theo các TCCS trong nước

35
2.4.1. Khảo sát sự ảnh hưỏfng của spiramycin đến kết quả định lưọTig
Metronidazol của các phương pháp theo TCCS trong nước 36
2.4.2. So sánh độ lặp lại và giá trị trung bình của kết quả định lượng
Metronidazol theo hai phương pháp 38
2.5. ứng dụng phương pháp định lượng vừa xây dựng để định lượng
một số chế phẩm nội chứa Metronidazol và Spiramycin
41

phần này trong viên nén bằng phương pháp phân tích đa cấu tử, chúng tôi
nhận thấy rằng Spiramycin trong môi trường NaOH cũng có khả năng hấp thụ
ánh sáng tử ngoại và đạt hấp thụ cực đại tại bước sóng 232nm.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng
đồng thời Metronidazol và Spiramycìn trong viên nén bằng phương pháp
quang phổ UV-Vis” với những mục tiêu sau;
i~ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Metronidazol và
Spiramycin trong viên nén Rodogyl bằng phưong pháp đo quang phổ hấp
thụ UV-Vis.
i- So sánh độ lặp lại và độ đúng của kết quả định lượng Metronidazol
giữa phương pháp vừa xây dựng với phương pháp theo các TCCS trong
nước.
i- ứng dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng một số chế phẩm
nội khác chứa Metronidazol và spiramycin.
Với mục tiêu như vậy, chúng tôi mong muốn giới thiệu một phương
pháp định lượng mới đơn giản và dễ thực hiện hơn, có thể áp dụng được cho
những cơ sở sản xuất, kiểm nghiệm không có đủ điều kiện cơ sở vật chất để
định lượng Spiramycin bằng phương pháp vi sinh vật.
PHÀN I
TỐNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN
1.1.1. Metronidazol [1][2][7][8][9][21][24][25][26]
i- Nguồn gốc: Metronidazol được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp
hoá học
i- Công thức phân tử : C6H9N3O3
4- Phân tử lượng : 171,16
4- Công thức cấu tạo :
CH
2
CH

amin thơm.
4 Cơ chế tác dụng;
Cơ chế tác dụng của Metronidazol còn chưa thật rõ. Trong ký sinh
trùng, nhóm 5-nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độc với tế
bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử ADN làm vỡ các
sợi này và cuối cùng làm cho tế bào chết đi.
Tác dụng:
Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium
và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng lên vi
khuẩn ái khí. Khi bị nhiễm cả vi khuẩn ái khí và kỵ khí, Metronidazol phải
được phối họp với các thuốc kháng khuẩn khác.
4- Chỉ định:
■ Điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn do Trichomonas vaginalis,
Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis ở trẻ em, Giardia lamblia
và Dracunculis.
■ Điều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn kỵ khí nhạy cảm như nhiễm
khuẩn ổ bụng, nhiễm khuẩn phụ khoa, nhiễm khuẩn da và các cấu
trúc da, nhiễm khuẩn hệ thần kinh trung ương, nhiễm khuẩn huyết và
viêm màng trong tim.
■ Viêm lợi hoại tử loét cấp, viêm lợi quanh thân răng và các nhiễm
khuẩn khác do vi khuẩn kỵ khí.
i- Liều dùng:
■ Uống : 500mg/lần x31ần/ngày xlOngày.
■ Tiêm tĩnh mạch : 500-750mg, 8 h truyền một lần, dùng 5-7ngày
■ Trẻ em : 30mg/kg cân nặng/ngày X lOngày.
■ Điều trị T.vaginalis : 250mg/lần X 31ần/ngày X 7ngày.
4- Chống chỉ định: Có tiền sử quá mẫn với Metronidazol hoặc các dẫn
chất nitro-imidazol khác
4- Dạng bào chế:
■ Viên nén 250mg, 500mg; kem bôi âm đạo 10%; thuốc trứng 500mg;

hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-10-[(2,3,4,6-tetradeoxy-4-
dimethylamino-D-e^//2rơ-hexopyranosyl)oxy]oxacyclohexadeca-
1 l,13-dien-2-on.
■ Spiramycin I I : 4-0-acetylspiramycin I.
■ Spiramycin III: 4-ơ-propanoylspiramycin I.
4 Tính chất vật lý
■ Bột trắng hoặc ánh vàng, hút ẩm nhẹ. Tan nhẹ trong nước, tan tốt
trong aceton, alcol và Methanol.Tan tốt trong acid.
■ Spiramycin I ; Nóng chảy ở nhiệt độ 134°C-137°C
Năng suất quay cực: [a]D^°= -96°
■ Spiramycin II : Nóng chảy ở nhiệt độ 140°-142°
Năng suất quay cực; [a]o^°= - 92,5°
■ Spiramycin III ; Nóng chảy ở nhiệt độ 128°-131 °
Năng suất quay cực: -83°
i- Tíiih chất hoá học:
■ Hấp thụ UV: dung dịch Img/lOOml trong Methanol có cực đại hấp
thụ ở bước sóng 232nm
■ Phản ứng màu: hoà tan Spiramycin trong acid sulfuric, xuất hiện màu
nâu.
4- Cơ chế tác dụng;
■ Kháng sinh sau khi thâm nhập vào tế bào vi khuẩn, gắn vào phần 50s
ribosom, ngăn cản sự vận chuyển acid amin dưới dạng aminoacid-
ARN-t đến các chuỗi peptid đang hình thành. Kết quả là sự tổng hợp
protein của vi khuẩn bị phong bế.
■ Tác dụng hỗ trợ: Spiramycin kích thích thực bào của bạch cầu trung
tính, làm tăng khả năng diệt khuẩn.
4 Tác dụng;
■ Spiramycin có tác dụng lên các vi khuẩn gram (+), các chủng Coccus,
chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria, Chlamydia, Actinomyces,
một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với

theo vào bình định mức 1 OOml, bổ sung NaOH tới vạch, lắc đều. Dung dịch
thu được đem đo mật độ quang ở bước sóng 319nm với mẫu trắng là NaOH
0,1N. A(l%,lcm) ở 3 19nm là 377. Song song tiến hành với chuẩn cùng điều
kiện.
8
Ậ- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [14]
Định lượng Metronidazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với chương
trình như sau:
■ Cột Supelco IC-AB2 (150 X 4,6mm, 5|Lim).
■ Detector u v đặt ở 292nm, độ nhạy 0,05 AUFS, Intergator:
Attenuation = 1; Minimum area = 1000; Speed 2 ; Stoptime = 6 .
- Pha động: acid phosphoric 0,01M: CHCN: CHOH (1000:225:25).
Metronidazol là một base Lewis, nên dùng pha động pH=2,4 (<3) có
lợi hơn dùng pH trung hoà. Metronidazol rất dễ tan trong acid, bề rộng của
pic sẽ hẹp và tính đối xứng được đảm bảo (hệ số cân đối 0,9-1,1).
4- Phương pháp định lượng trong môi trường khan:
- Chỉthịđothế[l][7][21][23]
Hoà tan một lượng chính xác Metronidazol trong acid acetic khan,
chuẩn độ bằng HCIO4 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn
độ đo thế. Iml dung dịch acid HCIO4 0,1N tưoTig đương với 17,12mg
C 6 H 9 N 3 O 3 .
- Chỉthịmàu[l][25][26]
Hòa tan một lượng chính xác Metronidazol bằng anhydrid acetic, đun
nóng nhẹ để hoà tan chất tan, làm lạnh và thêm 1 giọt thuốc thử xanh
malachite TS. Định lượng bằng acid HCIO4 0,1N, kết thúc định lượng khi
dung dịch có màu vàng xanh. Mỗi ml HCIO4 0,1N ứng với 17,12mg
C 6 H 9 N 3O 3.
1.1.3.2. Phương pháp định lượng Spiramycin [10][11][12][13][20][23]
Spiramycin được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật.
Chủng : Baccilus pumilus.

■ề- Điều chế các dung dịch chuẩn và thử:
■ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng chuẩn theo công thức sau
1.000.000 UI
Khối lượng (mg) =

Hoạt lực chuẩn (lU/mg)
Hoà tan trong một lượng methanol vừa đủ. Bổ sung methanol tới thể
tích lOOml để có dung dịch mẹ l.OOOUI/ml.
■ Dung dịch thử: nghiền 10 viên chế phẩm, cân chính xác một lượng
bột viên thêm metlianol, lắc kỹ, hoà loãng dịch lọc để có nồng độ
l.OOOUI/ml.
4- Tiến hành thử hoạt lực bằng phương pháp đưòng chuẩn.
1.1.3.3. Phương pháp định lượng Spiramycin và Metronidazol trong một chế
phẩm [10][11][12][13][20]
4- Với các chế phẩm chứa đồng thời Metronidazol và Spiramycin, các
TCCS trong nước đều tiến hành định lượng Metronidazol bằng phương pháp
đo quang phổ ƯV-Vis ở bước sóng hấp thụ cực đại của Metronidazol trong
môi trường acid là 277nm. spiramycin được định lượng bằng phương pháp vi
sinh vật. Cả hai phương pháp này đều đã được trình bày ở mục 1.1.3.1 và
1.13.2.
i- Phương pháp định lượng bằng đo quang phổ hấp thụ UV-Vis [13
Phưong pháp này dựa trên nguyên tắc “độ hấp thụ quang của một dung
dịch hỗn họp bằng tổng độ hấp thụ quang của các thành phần trong hỗn hợp
đó”. ME và SP trong môi trưòng HCl 0,1N đều có khả năng hấp thụ quang, và
có bước sóng cực đại lần lượt là 277nm và 232nm. Lần lượt đo mật độ quang
của các dung dịch thử hỗn hợp tại hai bước sóng này sẽ tìm ra được nồng độ
của mỗi thành phần. Tiến hành song song cùng các mẫu chuẩn.
11
1.2. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHÔ HẤP THỤ UV-VIS
1.2.1. Cơ s ở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp

■ Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả
định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng “tạo màu” (tạo khả
năng hấp thụ ánh sáng), phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các
thành phần tham gia phản ứng.
1.2.1.4. Một sổ đại lượng thông dụng
l- Độ truyền qua (T-Transmittance):
Độ truyền qua (hay là còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong
suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa;
lo
ThưÒTig T tính ra phần trăm (%). Một chất có T = 1 (hay 100%), nghĩa
là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong
suốt.
4- Độ hấp thụ (A-Absorbance):
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:
A = lgi =s.c.l
Đối với một chất xác định (có s xác định), thường đo trên một loại cốc
đo (có bề dày thông thưÒTig là 1 = Icm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với
nồng độ dung dịch:
A=K.C ( K = 8.1)
13
i- Hệ số hấp thụ phần trăm ( ):
Theo công thức A = 8.C.1, nếu 1 = Icm, c = 1% thì;
A = 8 = Eiự:
Vậy ElựJ chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc
đo có bề dày Icm. Với một chất tan xác định, tại một X xác định, là một
hằng số.
4- Hệ số hấp thụ phân tử (8 |^):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol, là độ hấp thụ của
dung dịch có nồng độ lM/1, dùng cốc đo có bề dày Icm.
Cũng như , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác

nhau, kết quả càng dễ chính xác hơn.
1.2.2.3. Phương pháp thêm chuẩn so sánh
Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ Cx Thêm một lượng
chất tan a (đã biết) vào dung dịch, đo độ hấp thụ A’x của dung dịch tạo thành.
Tacó: ^ =
^ X ~ ^ X ~ ^ X
Vậy nên, = Co X - -■
-^ x
1.2.2.4. Phương pháp đường chuẩn
Pha một dãy dung dịch chuẩn, đo A của chúng ở bước sóng đã chọn,
lập đồ thị của A theo c. Đo Ax của dung dịch trên và xác định Cx dựa vào
đưÒTìg chuẩn. (Hình 1.1).
Trong trường hợp dung dịch không tuân theo định luật Lambert-Beer
(đường chuẩn không thẳng) cần pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nồng độ
gần nhau hon (khác nhau không quá
10%).
15
Khi xây dựng đưòng chuẩn, người ta thường sử dụng đường chuẩn
tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng
trong định lượng nếu đường chuẩn cong (phi tuyến, không thẳng).
Đường chuẩn được lập dựa vào các điểm thực nghiệm, bằng phương
pháp bình phưong tối thiểu; tìm phưong trình hồi quy tuyến tính và hệ số
tương quan r. Trong định lượng, nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có
hệ số tưong quan r > 0,9995 là tốt.
1.2.2.5. Phương pháp thêm đường chuẩn
Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm vào những
lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng,
đo mật độ quang của các dung dịch đó. Vẽ đường chuẩn (đồ thị của độ hấp
thụ A theo lượng chất thêm vào). Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành
(nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng.(Hình 1.2)

■ Dung dịch không tìm được chỉ thị màu.
■ Dung dịch không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo
thế.
1.2.2.7. Phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ
Dựa trên tính chất cộng tính của độ hấp thụ ánh sáng ta có:
A t = A ] + A 2 +
___
Với hỗn họp có hai chất 1 và 2: At = Ai + A2
Lựa chọn các bước sóng Xx và ^2, đo độ hấp thụ Ati, At2 của hỗn hợp ở
hai bước sóng Ằ,1 và Ằ,2 đó.
Tâi I Atj ~ Eị \. C] "t" E2 Ị. C2
Tại A-2 : At2 = E1.2. Ci + £2.2- C2
18
Các hệ số là các hằng số đã biết, hoặc đã xác định được bằng thực
nghiệm. Giải hệ hai phương trình hai ẩn số trên, ta tính được Ci, C2.
Với hỗn hợp gồm có 3 chất: đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại 3 bước sóng
khác nhau, rồi giải hệ 3 phương trình 3 ẩn.
Có thể đo mật độ quang (độ hấp thụ) tại nhiều bước sóng hơn số chất
cần định lưọng (ví dụ đo tại 4-5 bước sóng khi định lượng hỗn họp gồm 2-3
chất) rồi tính kết quả.
Chú ý: trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất
không hấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kể thì ta có thể pha loãng
dung dịch rồi đo A như khi đo một chất.
Ví dụ; hỗn hợp Pethidin và Chlorocresol có:
Pethiden : E257 = 7,3 E279 = 0
Chlorocresol ; E257 = 20 E279 =105
Như vậy nếu ta đo A ở 279 nm, xác định được hàm lượng chlorocresol,
đo ở 257 nm, tính hiệu, được hàm lượng Pethidin.
* Phương pháp định lượng đồng thời Metronidazol và Spiramycin
trong viên nén mà chúng tôi xây dựng cũng sử dụng kỹ thuật định lượng này.