BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRỊNH THỊ DIỆP THANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRỊNH THỊ DIỆP THANH
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
ThS. Phạm Tuấn Anh
Nơi thực hiện
Bộ môn Dược liệu
HÀ NỘI – 2013
1.1.2. Saponin nhân Dammaran 2
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA
PENTAPHYLLUM 6
1.2.1. Chi Gynostemma Blume 6
1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 7
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG
SAPONIN 9
1.3.1. Chiết xuất 9
1.3.2. Tinh chế 9
1.3.3. Định lượng 10
1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 11
1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS 11
1.4.2. Định luật Lambert – Beer. 11
1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một
thành phần 13
1.5. TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ 15
1.5.1. Định nghĩa và phân loại 15
1.5.2. Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin 15
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 17
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 17
2.1.1. Nguyên liệu 17
2.2.2. Dụng cụ thiết bị 17
3.5.3. Kết quả 44
3.6. BÀN LUẬN 45
3.6.1. Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu 45 3.6.2.
Về khảo sát điều kiện đo quang 45
3.6.3. Về thẩm định phương pháp định lượng 45
3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam 47
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48
4.1. KẾT LUẬN 48
4.2. ĐỀ XUẤT 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C
chuẩn
, C
thử
: Nồng độ của chất chuẩn, chất thử
D
: Mật độ quang
ELSD
: Detector tán xạ bay hơi
(Evaporative light scattering detector)
ESI
: Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
EtOH
: Ethanol
G. : Gynostemma
1
Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G.
pentaphyllum
4
2
Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng
các phương pháp và dung môi chiết khác nhau
28
3
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi rửa giải
29
4
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng
33
5
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
33
6
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
34
7
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
35
8
Bảng 3.7. Kết quả xây dựng đường chuẩn
37
9
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
38
10
Hình 1.5. Ảnh của cây Giảo cổ lam
7
6
Hình 1.6. Kĩ thuật thêm đường chuẩn
14
7
Hình 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
19
8
Hình 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu
20
9
Hình 2.3. Máy chiết siêu âm
20
10
Hình 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp
cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau
21
11
Hình 3.1. Quy trình tinh chế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết
lỏng-lỏng
31
12
Hình 3.2. Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng
32
13
Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
33
14
Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây
dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được
sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm
phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam
bằng phương pháp đo quang” với các mụ
c tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu
Giảo cổ lam.
2. Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam
bằng phương pháp đo quang.
3. Thẩm định phương pháp xây dựng được và ứng dụng để định lượng saponin
toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam.
2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN
1.1.1. Saponin [15]
• Định nghĩa
Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong
thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao.
• Phân loại, cấu trúc hóa học.
- Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia thành saponin
triterpenoid và saponin steroid.
- Saponin triterpenoid có loại trung tính và loại acid, saponin steroid có loại
trung tính và loại kiềm.
- Saponin triterpenoid có phần genin gồm 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm
hemiterpene, chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin
triterpenoid tetracyclic.
+ Saponin triterpenoid pentacyclic: gồm 4 nhóm là olean, ursan, lupan hopan.
17
18
19
20
21
22
24
26
27
23 25
28 29
30
Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
• Tác dụng sinh học của các saponin nhân Dammaran
Có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng của triterpenoid dammaran trong
nhân sâm và các loài thuộc chi Gynostemma, trong đó nổi bật là các tác dụng
- Chống mệt mỏi và tăng sức đề kháng: các saponin triterpenoid tetracyclic
nhóm dammaran của nhâm sâm có tác dụng cải thiện rõ rệt tinh thần cũng như thể
chất, tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh cũng
đã được chứng minh.
- Tác dụng hạ cholesterol đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm.
- Tác dụng hạ đường huyết do các saponin này có khả năng chuyển glucose
thành glycogen và ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen.
• Các saponin trong chi Gynostemma
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc
nhóm dammaran. Đã có trên 100 saponin trong thành phần G. pentaphyllum được
phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại
protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [24],
[32], Rc [27], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [27], Rg3 [29],
1
Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong
G.pentaphyllum
CH
2
OH
OH
OH
OOH
O
OCH
3
CH
2
O
OH
Glu
O
Rha
a
b
c
d
e
f
g
h
i
R
5
- OH
- đường đôi
Rg3, Rf
Rb1, gymnemasid II
R
6
- CH
3
hoặc - CH
2
OH
- CH
2
O -glu hoặc CH
2
O –xyl
Rb1
R
7
Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i
Các ginsenoid đều có cấu trúc a
5
Loại đường chính trong saponin của GCL (hầu hết thuộc dạng pyranose) là β-
D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20.
Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH
3
, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là
H
O
H
O
H
O
O
O
O
H
H
O O
H
O
H
H
O
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Rb1
- Công thức phân tử: C
54
H
92
O
23
- Trọng lượng phân tử
: 1109.29448
(g/mol).
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH,
H
cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi
hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột.
Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô. Bầu hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy
với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2-3 hạt
hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi.
Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và
Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Loài G.
pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca,
Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [
34].
7
• Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [5], [10], chi Gynostemma
có 2 loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino và G. laxum (Wall.) Cogn. Năm 2009
Ths. Hoàng Văn Lâm đã công bố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung
vào hệ thực vật Việt Nam là G. longipes C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [22].
Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố ở Việt Nam.
1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM
• Đặc điểm thực vật.
Hình 1.5. Ảnh cây Giảo cổ lam
Cây thảo mọc leo, yếu, thân cành
mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có
lông thưa thớt ở mấu. Lá kép chân vịt,
cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7
lá chét với mép có răng. Tua cuốn
mảnh, xẻ đôi ở đỉnh. Cụ
m hoa đ
ực
dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh,
dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen, ức
chế giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH).
- Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300
mg/kg thể trọng trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng
thành phần có hoạt tính trong huyết thanh, giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng
IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim.
- Tác dụng chữa khối u: tác dụng này do một vài saponin có trong G.
pentaphyllum. Khi dùng gypenosid liều 30mg/kg và 300mg/kg qua dạ dày hoặc
120mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày nhận thấy tác dụng cản trở quá
trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt.
- Cao G. pentaphyllum (450 mg/kg) ức chế những hoạt động tự phát của chuột
nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột đang ở trên tấm kim loại nóng.
9
Các nghiên cứu về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu GCL
có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u và
tăng đáp ứng miễn dịch [2], [7], [8], [11], [12].
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH
LƯỢNG SAPONIN
1.3.1. Chiết xuất [15]
- Saponin loại trung tính và acid: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để
loại chất béo, chiết saponin bằng methanol-nước (4:1). Loại methanol dưới áp suất
giảm. Hoà cặn trong nước được dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-
butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để chấm sắc
ký. Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng
lớn gấp 10-15 lần (có thể dùng aceton hoặc n-hexan thay ether).
- Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột
dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy. Dịch lọc đem bốc hơi
đến khô. Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 80
0
C rồi kiềm hoá
Bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, sau đó chiết
saponin bằng MeOH:H
2
O = 4:1. Loại MeOH dưới áp suất giảm. Hòa cặn trong
nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol. Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung
môi dưới áp suất giảm đến cắn, để trong bình hút ẩm, cân đến khi khối lượng không
đổi. Thực hiện thao tác chiết, cân, lấy trung bình 3 lần và suy ra lượng saponin thô
toàn phần trong dược liệu.
Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:
S =
)
1( x
M
a
−×
%
100× • Phương pháp HPLC
Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định lượng
các chất nói chung và saponin nói riêng.
- Pha tĩnh cho HPLC dùng kiểm nghiệm các saponin thường là pha đảo RP-18.
Pha tĩnh theo cơ chế rây phân tử cũng có thể được dùng.
- Hệ dung môi được sử dụng trong HPLC là hỗn hợp nước-methanol-
acetonitril với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm. Chương trình
+ E
v
+ E
r
(E
e
>> E
v
>> E
r
)
Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại-khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện
tử E
e
và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử.
1.4.2. Định luật Lambert – Beer [1].
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I
0
qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là L. Khi đi qua dung dịch, một
phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung
dịch với cường độ I .
Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và
thể hiện bằng định luật Lambert - Beer
Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc nồng
độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào
dung dịch.
* Điều kiện ứng dụng của định luật.
- Chùm tia sáng phải đơn sắc.
13
Cũng như
, với 1 chất xác định, trong điều kiện đo nhất định (bước sóng,
dung môi, nhiệt độ…)
là 1 hằng số.
Giữa
và có mối liên hệ
Trong đó: M là phân tử lượng gam của chất tan.
1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một
thành phần [3]
Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng sau.
• Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo được
Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một
bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong
dung môi tương ứng tại bước sóng này. Nồng độ dung dịch được tính theo công
thức:
Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng
và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng
đáp ứng của định luật Lambert – Beer.
• Đo so sánh với dung dịch chuẩn
Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ C
x
(chưa biết) được tiến
hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ C
c
đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer thì C
x
được
tính theo công thức:
C
A
A
=→=
14
và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch
chuẩn. Trong trường hợp các dung dịch đo thỏa mãn điều kiện định luật Lambert-
Beer thì đường chuẩn thẳng, sau đó từ mật độ quang của dung dịch thử, dựa vào
phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ của dung dịch thử.
• Kỹ thuật thêm chuẩn
Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch thử một
lượng chính xác chuẩn làm cho nồng độ dung dịch tăng thêm một lượng C
o.
Đo mật
độ quang của dung dịch thử (A) và dung dịch thử thêm chuẩn (A’), nồng độ của
dung dịch thử được tính theo công thức
= C
x
= * C
o
• Kỹ thuật thêm đường chuẩn
Được tiến hành bằng cách thêm chính xác các lượng chất chuẩn khác nhau vào
dung dịch cần định lượng. Vẽ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ của mật độ quang
và nồng độ dung dịch thử thêm chuẩn. Giao điểm của đường chuẩn với trục nồng độ
là giá trị nồng độ dung dịch cần định lượng.
C
x
x
A
Nghiên cứu đã chứng minh
nhựa hấp phụ còn cho hiệu quả tốt trong việc loại bỏ đường hòa tan trong nước và
các tạp chất khác. Phương pháp tách chiết dung môi thông thường có chi phí cao,
quá trình phức tạp, đặc biệt là việc sử dụng chiết xuất bằng dung môi hữu cơ là khó
khăn hơn trong sản xuất thực tế. Quy trình mới sử dụng nước – ethanol và nhựa hấp
phụ không chỉ đơn giản, tiết kiệm mà sản lượng sản phẩm và chất lượng còn được
cải thiện đáng kể [33]. Zhang Chongxi sử dụng nhựa D101 cho tỉ lệ thu
Ginsenosides lên đến 90% với độ tinh khiết cao nhất, đưa tổng hàm lượng saponin
16
trong nhâm sâm khô đạt 60% [36]. Liu Chen và cộng sự nghiên cứu sử dụng trên
Ngũ gia bì (Acanthopanax) với 3 loại nhựa D101, NKA9, AB8, sử dụng phương
pháp HPLC để định lượng glycoside D. Kết quả D101, NKA9, AB8 có khả năng
hấp phụ bão hòa tương ứng là 11.88 mg/g; 7.92 mg/g và 12.18 mg/g [26]. Li-Sheng
Wang và cộng sự dùng phương pháp TLC để kiểm tra khả năng hấp phụ của nhựa
D101 đối với saponin trong Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis). Kết quả nhựa
D101 có thể hấp phụ 8,7% đến 27,3% saponin, tăng 20% - 52,1% so với phương
pháp thông thường [25].
Copyright: Tài liệu đại học ©