BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG
GIẢO CỔ LAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG
MÃ SINH VIÊN : 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG
GIẢO CỔ LAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh
2. ThS. Ngô Minh Thúy
Nơi thực hiện:
Bộ môn Vật lý – Hóa lý

HÀ NỘI - 2016

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM ................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume .................................................. 2
1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume ................................... 2
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume ....................... 2
1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam .......................... 3
1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum .................................... 3
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật: .................................................................... 3
1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum: .............................. 4
1.1.2.3. Phân bố:..................................................................................... 5
1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính .......................................................... 5
1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. ................... 6
1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM ............. 6
1.2.1.

Phương pháp cân ............................................................................ 7

1.2.2.

Phương pháp đo quang ................................................................... 7

1.2.3.

Phương pháp HPLC........................................................................ 9

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ( UVVIS) .............................................................................................................. 11
1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS. .................................................................... 11
1.3.2. Định luật Lambert-Beer................................................................. 11
1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch
một thành phần .......................................................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 16

n-BuOH: n-Buthanol
G: Gynostemma


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

TÊN BẢNG

TRANG

1

Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu Giảo cổ lam dùng trong nghiên
cứu

16

2

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết

26

3

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tuyến tính của quy trình định
lượng

27


Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin
triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b)

4

2

Hình 1.2. Cơ chế phản ứng tạo màu

8

3

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII

10

4

Hình 1.4. Nguyên tắc của định luật Lambert-Beer

12

5

Hình 1.5. Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A = f (C)

14


11

Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n
= 3)

23

12

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa
nồng độ saponin gypenoside XVII và độ hấp thụ

27


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, xu hướng tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo
dược ngày càng tăng. Việt Nam có ưu thế về nguồn cây phong phú và lịch sử
lâu đời sử dụng dược liệu trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ dưỡng
nâng cao sức khỏe của người dân. Gỉao cổ lam hay Bổ đắng ( Việt Nam ) là
một cây được dùng phổ biến trong dân gian làm thuốc, chè uống và thức ăn.
Có nhiều nghiên cứu cho thấy chế phẩm G. Pentaphyllum rất có lợi cho sức
khỏe như điều trị bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, ung thư, viêm gan, các
bệnh thần kinh và có thể giúp giảm bớt căng thẳng, chống viêm, giảm mệt
mỏi, hạ cholesterol và triacylglycerol. Chất có hoạt tính trong G.
Pentaphyllum có thể là polysaccharide, flavonoid, saponin, carotenoid,
clorophyl và sterol. Trong đó, flavonoid và saponin được coi là nhóm chất có
hoạt tính sinh học chính.

Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược
như sau:


Ngành Ngọc lan Magnoliophyta



Lớp Ngọc lan Magnoliopsida



Phân lớp Sổ Dilleniidae



Liên bộ Hoa tím Violanae



Bộ Bí Cucurbitales



Họ Bầu bí Cucurbitaceae



Chi Gynostemma.


thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 –
3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [10]. Cụm hoa đực
dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài rất ngắn, thùy đài
hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc
mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa
đực. Hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3,
nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín
màu đen. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù,
gốc hình tim dẹt. Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [3], [9], [10].
Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi
từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [10].


4

1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum:
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam
thuộc nhóm dammaran (hình 1.1.a). Đã có trên 100 saponin trong thành phần
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu
trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenoside
của Panax ginseng C. A. Mayer là Rb1 (Gypenoside III) [24], [25], Rc [33],
Rb3 (Gypenoside IV), Rd (Gypenoside VIII), F2 [33], Rg3, malonyl-Rb1 và
malonyl-Rd [25]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [33] (hình
1b). Những ginsenoside đó chiếm khoảng 25% tổng gypenoside toàn phần
trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm
thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một số Gypenoside XXVIII, XXXVII, LV,
LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestre (Retz) Schult [19].
Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenoside được phát hiện lần đầu ở
loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino.


liệu Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường
huyết, chống khối u [6] và tăng đáp ứng miễn dịch [7].


6

Về độc tính
Nhóm

tác

giả

Thái

Lan

Natthakarn

Chiranthanut,

Supanimit

Teekachunhatean và cộng sự (2013) đã đánh giá độc tính của dịch chiết
Gynostemma pentaphyllum Makino trên chuột thí nghiệm kết quả không phát
hiện được liều gây độc trên chuột (liều 750 mg dược liệu/kg chuột không phát
hiện gây độc) [26].
Thực tế cho thấy, Giảo cổ lam đã được dùng từ lâu đời nhưng vẫn chưa có
ghi nhận nào về độc tính của dược liệu này được công bố.


aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, hòa tan tủa trong 50 ml nước nóng, đun cách thủy
cho tan hết. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và chiết saponin bằng n-butanol 8 lần,
mỗi lần với 25 ml n-butanol. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy
đến khô. Sấy cắn ở 60oC đến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm lượng
saponin toàn phần theo dược liệu khô [1].

1.2.2. Phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang có nhiều ưu thế khi áp dụng cho những hoạt chất
trong nhóm có cùng dạng cấu trúc, cùng tác dụng sinh học. Đa số các saponin
ít có nối đôi nên thường chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 - 195 nm.
Để có thể định lượng được cần thực hiện phản ứng với các thuốc thử khác
nhau tùy theo cấu trúc của saponin, sản phẩm tạo thành có khả năng hấp thụ ở
vùng khả kiến. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng, dựa vào chuẩn làm
trong cùng điều kiện, tính được hàm lượng saponin toàn phần.
Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin – sulfuric; các
saponin cho màu tím với thuốc thử này. Một số nghiên cứu phản ứng màu của
saponin khung dammaran, cho thấy chính nhóm OH tại C3 là nguyên nhân gây
phản ứng loại H2O tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với Vanillin/acid
sulfuric đặc. Cơ chế trình bày theo hình 1.2.
Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh [4] sử dụng
ethanol 70% chiết saponin từ 10 g dược liệu bằng chiết siêu âm, cất thu hồi


8

dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, sấy ở 60oC đến cắn khô. Hòa tan cắn
trong nước cất và cho hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể
tích/thể tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng nước cất, MeOH 20% và MeOH
80% đến kiệt saponin (khoảng 200 ml). Thu dịch MeOH 80%, bốc hơi đến
cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH và đem phản ứng với thuốc thử

dicloromethan. Cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong methanol và
tiến hành phân tích bằng HPLC với detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ESLD).
Yêu cầu hàm lượng panaxadiol (C30H52O3) không nhỏ hơn 0,094% tính theo
dược liệu khô. Tuy nhiên, các công bố thu thập được và khảo sát sơ bộ bằng
thực nghiệm của nhóm nghiên cứu chúng tôi thì không phát hiện có panaxadiol
trong các mẫu Giảo cổ lam Việt Nam dùng trong nghiên cứu.
Tác giả Lu, J.G., et al., [20] đã so sánh hàm lượng các chất có trong
Gynostemma pentaphyllum vị ngọt và vị đắng. Nhóm nghiên cứu sử dụng
UPLC-Q-TOF-MS và HPLC-ELSD để định tính và định lượng các saponin
trong 21 mẫu dược liệu. Kết quả đã chỉ ra rằng 10/10 mẫu Giảo cổ lam đắng
hàm lượng 4 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, F2 hầu như không có hoặc rất thấp
trung bình 8,3 µg/g so với 823,9 µg/g của 11 mẫu Giảo cổ lam ngọt. Cụ thể là
10/10 mẫu không có Rb1, Rb3, Rd 5/10 mẫu không có, 5/10 mẫu có Rd nhưng
hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 3,6 – 33,7 g/g


10

so với 129 – 835 g/g – 11 mẫu nghiên cứu), F2 7/10 mẫu không có, 3/10 mẫu
có F2 nhưng hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 2,5
– 11,2 µg/g so với 8,4 – 476,2 µg/g– 11 mẫu nghiên cứu).Tác giả SHI Meirong et al. [27] dùng HPLC với detectơ UV đo ở bước sóng 203 nm định lượng
3 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd và gypenoside XVII, XLIX trong 32 mẫu
Gynostemma pentaphyllum ngọt và đắng thu hái tại các cùng khác nhau ở
Trung Quốc kết quả cho thấy khoảng 2/3 số mẫu không có chứa Rb1, Rb3, đa
số các mẫu đều có Gypenoside XVII và XLIX và Rd.
Tác giả Kao, T.H., et al., đã xác định được 34 gypenoside trong
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng LC-MS/MS [18].
Từ những tài liệu thu thập được, chúng tôi thấy rằng trong Giảo cổ lam có
rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng không có saponin gypenoside nào có
hàm lượng đủ lớn hoặc tác dụng dược lý nổi bật để làm đối tượng định lượng

của chuyển động quay ( Er )
Phương trình biểu diễn:

E_tổng = Et + Ee + Ev + Er
(Ee >> Ev >> Er)

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại – khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng
điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là
phổ điện tử.

1.3.2. Định luật Lambert-Beer.


12

Định luật là cơ sở lý thuyết cho phép định lượng bằng quang phổ UV-VIS. Khi
chiếu một chùm tia sáng đơn sắc bước sóng  với cường độ ánh sáng I0 đi qua
dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày l thì cường độ ánh sáng sau đó chỉ
còn lại I.

Hình 1. 4. Nguyên tắc của định uật Lambert-Beer

Mối quan hệ giữa I và I0 được biểu diễn bằng biểu thức:
I = I0.10-.l.C
Trong đó:  là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch, chỉ phụ thuộc vào bản chất
chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch.
T=I/Io.100% được gọi là độ truyền qua.
A=(Io-I)/Io.100% được gọi là độ hấp thụ.
Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc bản chất của chất
tan, chiều dày lớp mỏng và nồng độ của dung dịch.

 Kỹ thuật đƣờng chuẩn.


14

- Chuẩn bị từ 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ xác định và nằm trong khoảng
tuyến tính của định luật Lambert – Beer.
- Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương
quan giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn. Từ đó rút ra
được phương trình đường chuẩn.
- Tiến hành đo đồng thời mật độ quang At của dung dịch thử có nồng độ Ct.
Dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được ở trên ta tính được Ct khi đã
biết At.
- Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert – Beer (đường
chuẩn cong) thì cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với nồng độ gần nhau
hơn (khác nhau không quá 10%).

Hình 1.5. Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn A = f (C)

 Kỹ thuật thêm chuẩn.
- Thêm chính xác một được dung dịch chuẩn có nồng độ Cc xác định vào dung
dịch thử cần xác định nồng độ Ct.
- Tiến hành đo mật độ quang của 2 dung dịch trong cùng điều kiện thỏa mãn
định luật Lambert – Beer.
- Nồng độ dung dịch thử được tính theo côgn thức sau:


15

 Kỹ thuật thêm đƣờng chuẩn.

Lào Cai

5 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược

1

M01

2

M02

3

M03

Thị trường

Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu

4

M04

Hòa Bình

Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu

liệu
Lào Cai

- Dung môi chiết: sử dụng các dung môi methanol, aceton và
ethanol. Lựa chọn dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất.
- Thời gian chiết: chiết mẫu với thời gian chiết khác nhau. L ựa
chọn phương pháp cho hi ệu suất chiết cao.
* Điều kiện phản ứng và đo quang
Dựa vào tài liệu [2] đánh giá lại các điều kiện phân tích thay
đổi nếu cần thiết.

2.2.2. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của AOAC với các chỉ
tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (độ lặp