BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY
Ô ÐẦU (A. carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở
TỈNH HÀ GIANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU ÐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
VÀ POLYSACCHARID TRONG CÂY
Ô ÐẦU (A.carmichaeli Debx.) TRỒNG Ở
TỈNH HÀ GIANG

Nguyễn Thị Nhung
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về cây Ô Đầu 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Phân bố và trồng hái 3
1.1.3. Bộ phận dùng 3
1.1.4. Thành phần hóa học 3
1.2. Tổng quan về Flavonoid 4
1.2.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 4
1.2.2. Tính chất 4
1.2.3. Các phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu 5
1.3. Tổng quan về polysaccharid 7
1.3.1. Định nghĩa, cấu trúc và phân loại 7
1.3.2. Tính chất 7
1.3.3. Phương pháp định lượng polysaccharid trong dược liệu 8
1.4. Tổng quan về phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)
…… 9
1.4.1. Nguyên tắc 9
1.4.2. Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp đo quang 11
1.5. Thẩm định phương pháp phân tích 13
1.5.1. Độ đặc hiệu 13
1.5.2. Độ tuyến tính 13
1.5.3. Độ lặp lại 13
1.5.4. Độ đúng 14

3.2.3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để xác định hàm lượng
polysaccharid toàn phần trong mẫu phụ tử Hà Giang 35
BÀN LUẬN 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
A. KẾT LUẬN 38
B. KIẾN NGHỊ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EtOH:
Ethanol
MeOH:
Methanol
2,4-DNP:
2,4- dinitrophenylhydrazin
UV-VIS:
Ultraviolet-Visible (Tử ngoại-khả kiến)
HPLC:
High Performance Liquid Chromatography ( Sắc kí lỏng hiệu năng cao)
PA:
Pure Analysis ( Tinh khiết phân tích)
PTN:
Phòng thí nghiệm
LOD:
Limit of detection (giới hạn phát hiện)
LOQ:
Limit of quanlity (giới hạn định lượng)

Hình 1.1. Tiêu bản cây Ô đầu 2
Hình 1.2. Cành mang hoa, quả của cây Ô đầu 2
Hình 1.3. Rễ củ ô đầu, phụ tử 3
Hình 1.4. Lá của cây Ô đầu 3
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn quercetin và mẫu thử 23
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ
quercetin. 24
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn glucose và mẫu thử 31
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của độ hấp thụ và nồng độ glucose….33

1
ÐẶT VẤN ÐỀ
Cây Ô đầu (Aconitum sp.) là một loại cây thuốc quý được sử lâu đời trong y
học cổ truyền dân tộc với tên vị thuốc là Ô đầu (Radix aconiti) và phụ tử hay củ con
của cây Ô đầu (Radix aconiti lateralis). Ô đầu, phụ tử chưa chế biến chủ yếu dùng
ngoài để xoa bóp khi nhức đầu, mỏi tay chân, đau khớp, bong gân; phụ tử chế (diêm
phụ, bạch phụ, hắc phụ) y học cổ truyền coi là một vị thuốc hồi dương khử phong
hàn, dùng trong một số triệu chứng nguy cấp (trụy tim mạch, ra nhiều mồ hôi, chân
tay giá lạnh…) [3]. Cây Ô đầu Việt Nam (Aconitum carmichaeli) mọc hoang và
được trồng ở các vùng núi cao như Hà Giang, Lào Cai, Sa Pa [10], [11].
Trong cây Ô đầu hoạt chất chính và có tác dụng dược lý mạnh nhất là alcaloid
đã được ứng dụng nhiều trong y học cổ truyền. Ngày nay với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật đã và đang có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của các
thành phần khác trong cây Ô đầu để ứng dụng trong y học như: flavonoid trong lá và
polysaccharid trong rễ củ cây Ô đầu. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần
flavonoid trong lá Ô đầu có tác dụng chống oxy hóa và khả năng dọn dẹp gốc tự do
[24], [27], [35], [37]. Polysacharaid trong rễ củ ô đầu có tác dụng: chống oxy hóa,

cong hình mũ chụp kín tràng hoa đã tiêu giảm, nhị nhiều, bầu có 3 ô chứa nhiều lá
noãn.
Quả gồm 5 đại mỏng, hạt nhiều, trên mặt có nhiều vảy nhỏ.

Hình 1.1. Tiêu bản cây Ô đầu
Hình 1.2. Cành mang hoa, quả của cây
Ô đầu
3

Hình 1.3. Rễ củ ô đầu, phụ tử Hình 1.4. Lá của cây Ô đầu
1.1.2. Phân bố và trồng hái
Ô đầu là cây của vùng ôn đới ẩm. Cây trồng ở Việt Nam thích nghi cao với
điều kiện khí hậu ẩm mát của vùng nhiệt đới núi cao như Sa Pa, Bắc Hà, Sìn Hồ,
Đồng Văn, Quảng Bạ… Cây ưa sáng, khi còn nhỏ là cây chịu bóng [8], [9], [15].
Ô đầu được trồng bằng hạt hoặc củ con. Người ta thường thu hoạch khi cây
trồng được 1-2 năm, cắt bỏ rễ con, rửa sạch đất, phơi hay sấy khô. Nếu cần thu lấy
hạt thì đợi khi thu hạt xong tiếp tục chăm sóc để thu củ vào mùa hoa năm sau. Ở
nước ta thu hái vào khoảng tháng 9, tháng 10 khi cây đang ra hoa. Trồng vào tháng
1, tháng 2 [3], [8], [18].
1.1.3. Bộ phận dùng
Bộ phận dùng của cây Ô đầu là rễ củ [2], [8] :
- Ô đầu là rễ củ mẹ của cây Ô đầu phơi hay sấy khô.
- Phụ tử là củ nhánh (củ con) của cây Ô đầu. Từ phụ tử có thể chế thành diêm
phụ, hắc phụ, bạch phụ.
1.1.4. Thành phần hóa học
Các thành phần hóa học trong cây Ô đầu khá đa dạng và phong phú. Theo một
số tài liệu tham khảo tất cả bộ phận của cây Ô đầu đều chứa alcaloid trong đó

flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hiệp giữa
5
vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu
thay đổi tuỳ theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi flavonoid ở trong các bộ phận
của cây thì màu sắc của chúng còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác.
- Ðộ tan: Độ tan của các flavonoid không giống nhau. Thường flavonoid glycosid
và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung
môi hữu cơ, tan được trong nước và tan tốt nhất trong hỗn hợp cồn nước. Các
aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các
dẫn chất flavonoid có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng.
1.2.3. Các phương pháp định lượng flavonoid trong dược liệu
1.2.3.1. Phương pháp cân
- Nguyên tắc: Chiết xuất và tinh chế thành phần flavonoid trong dược liệu sau đó
đem cân để tính ra hàm lượng flavonoid có trong dược liệu.
- Ứng dụng đối với nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết ít tạp chất, ví dụ định
lượng rutin trong hoa hòe hay định lượng flavonoid trong thịt quả mơ :
+ Định lượng flavonoid trong thịt quả mơ (Prunus armeniaca) bằng phương
pháp cân [23]: Bột dược liệu chiết bằng CHCl
3
trên bình Soxhlet để loại tạp, sấy
khô. Chiết bằng EtOH 96% trên bình Soxhlet thu lấy dịch, sau đó bốc hơi dung môi.
Chiết lại bằng nước nóng sau đó chiết bằng EtOAc bay hơi dung môi. Thu được
cắn. Cân cắn để xác định lượng flavonoid toàn phần.
+ Định lượng rutin trong nụ hoa hòe (Sophora japonica) [1]: loại tạp bằng HCl
0.5%, chiết bằng EtOH 96% nóng, thủy phân bằng H
2
SO

heterophyllum
Bột củ
AlCl
3
/EtOH(20mg/
ml); AcOH
Rutin
415 nm
[36]
2
Trikarshika
*

Bột hỗn
hợp
2,4-DNP 1% ;
KOH 1%/ MeOH
70%
Quercetin
415 nm
[31]
3
Chrysanthemum
indicum L.
Bột hoa
khô
AlCl
3
2% /MeOH
Quercetin

3
5% / MeOH
Galangin
425nm
[32]
2,4-DNP 1% ,
KOH 10 %/ MeOH
Pinocembrin
486nm
6
Crinum
lactifolium
Bột lá
AlCl
3
5% / MeOH
chứa 5% AcOH,
natri citrat 1%
Quercetin
425nm
[20]
7
Cleistocalyx
operculatus
Nụ và lá
NaNO
2
5% , AlCl
3


dị thể (heteropolysaccharid).
+ Tùy theo nguồn gốc người ta phân các polysaccharid tự nhiên ra ba nhóm
lớn: Pytopolysaccharid (polysaccharid thực vật), Zoopolysaccharid (polysaccharid
động vật) và Polysaccharid vi sinh vật.

1.3.2. Tính chất [1]
Polysaccharid mang nhiều tính chất khác mono- và disaccharid như không có
phản ứng khử, không có vị ngọt, thường không tan trong nước, khi hòa tan dễ hình
thành dung dịch keo.
8
1.3.3. Phương pháp định lượng polysaccharid trong dược liệu
Trong số nhiều phương pháp so màu định lượng carbohydrat, phương pháp
dùng thuốc thử phenol-acid sulfuric là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và đáng
tin cậy nhất để xác định hàm lượng carbohydrat toàn phần trong mẫu. Phương pháp
có thể áp dụng định lượng tất cả các loại carbohydrat: mono-, di- , oligosaccharid,và
polysaccharid; kể cả lượng đường trong proteoglycan, glycoprotein và glycolipid
[38], [39]. Phương pháp sử dụng thuốc thử phenol- acid sulfuric được sử dụng rộng
rãi vì độ nhạy và cách tiến hành đơn giản [39].
- Nguyên tắc:
Trong phương pháp này dung dịch acid sulfuric đậm đặc thủy phân
polysaccharid, oligosaccharid, và disaccharid thành các monosaccharid. Sau đó các
monosaccharid mất nước tạo thành furfural (Pentose) hoặc hydroxymethyl furfural
(hexose). Các hợp chất này phản ứng với phenol tạo thành hợp chất màu vàng. Đối
với các mẫu thử có hàm lượng đường pentose cao sẽ có cực đại hấp thụ tại 480 nm.
Đối với mẫu thử có hàm lượng đường đường hexose cao sẽ có cực đại hấp thụ tại
490 nm. Màu sắc của sản phẩm tạo màu ổn định trong vài giờ, và độ chính xác của
phương pháp tương đối cao [35].

4,62 %
[43]
9
3
Aconitum
carmichaeli
Phụ tử (củ con)
Ô đầu (củ mẹ)
Rễ con
484 nm
22,02 %
33, 53%
6,10%
[44]
4
Aconitum
coreanum
Bột rễ
490 nm
5,7%
[34]
5
Aconitum
kusnezoffii
Bột rễ
490nm
6,0%

CL
II

0
10




Trong đó : ε : là độ hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào
nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của
chùm tia đơn sắc chiếu vào dung dịch.
L : là bề dày của lớp dung dịch (cm)
C : là nồng độ của dung dịch
- Điều kiện ứng dụng định luật
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc.
+ Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp.
+ Dung dịch phải trong suốt.
10
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh
sáng UV-VIS
1.4.1.2. Một số đại lượng thông dụng
- Độ truyền qua
Độ truyền qua hay còn gọi là độ thấu quang (T): Đặc trưng cho độ trong suốt
( về mặt quang học) của dung dịch, được tính theo công thức:
0
I

E
1
%1
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1% khi dùng cuvet đo có bề
dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một bước sóng đo xác định,
cm
E
1
%1
là một
hằng số.
- Hệ số hấp thụ phân tử (
M

)
Hệ số hấp thụ phân tử còn gọi là hệ số hấp thụ mol là độ hấp thụ của dung dịch
có nồng độ 1M, khi dùng cuvet đo có bề dày 1cm.
Cũng như
cm
E
1
%1
, với một chất xác định, trong điều kiện đo nhất định( bước sóng,
dung môi, nhiệt độ…),
M


là hằng số.
Giữa
cm

x
E
A
C
1
%1


Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng
và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng
đáp ứng của định luật Lambert- Beer.
1.4.2.2. Kỹ thuật so sánh với dung dịch chuẩn
Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ C
x
(chưa biết) được tiến
hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ C
c

đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert- Beer thì C
x
được
tính theo công thức

Trong phương pháp so sánh kết quả càng chính xác khi nồng độ C
x
càng gần
với nồng độ dung dịch chuẩn C
c
.
1.4.2.3. Kỹ thuật đường chuẩn

chuẩn thêm vào. Giao điểm của đương chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng
độ của chất cần định lượng.

13
1.5. Thẩm định phương pháp phân tích [6], [7]
1.5.1. Độ đặc hiệu
- Định nghĩa: Là khả năng xác định được chất phân tích khi có mặt các thành
phần khác như tạp chất, sản phẩm phân hủy, tá dược… Với phép thử định lượng
phải đưa ra kết quả chính xác về hàm lượng hay hoạt lực của chất phân tích có trong
mẫu.
- Cách xác định: Thêm vào sản phẩm một lượng thích hợp tạp chất hoặc tá dược
rồi phân tích để chứng minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi tạp
chất hoặc tá dược.
1.5.2. Độ tuyến tính
- Định nghĩa: Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến
tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác
định. Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y=ax+b và hệ số tương quan
tuyến tính r.
- Cách xác định: Chuẩn bị 1 dãy gồm 5-10 dung dịch chuẩn có nồng độ x
i
tăng
dần x
1
, x
2
, … x
n

. Trung bình các kết quả là



n
i
i
x
n
X
1
1

Ta tính độ lặp lại theo công thức sau:
+ Độ lệch chuẩn:
1
)(
1
2





n
Xx
SD
n
i
i

dược có trong chế phẩm với hàm lượng hoạt chất khoảng 90%, 100%, 110% hàm
lượng ghi trên nhãn. Tiến hành định lượng hoạt chất theo phương pháp phân tích
cần đánh giá. Độ đúng là tỉ lệ phần trăm giữa kết quả định lượng so với hoạt chất
cho vào.
+ Cách xác định trên mẫu thử được thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử một lượng
chất chuẩn ( khoảng 10%, 20%, 30% so với lượng hoạt chất có sẵn sao cho tổng
lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định
lượng theo phương pháp phân tích đề ra. Độ đúng sẽ được tính bằng tỉ lệ phần trăm
giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào.
1.5.5. Giới hạn phát hiện (LOD)
- Định nghĩa: Giới hạn phát hiện là lượng chất thấp nhất cần phân tích có thể phát
hiện được về mặt định tính.
- Cách xác định:
+ Cách 1: Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S). Thiết lập tỉ số
S/B. Nếu S/B = 3/1 là chấp nhận được.
+ Cách 2: Đo độ lớn của đường nền bằng cách phân tích một số mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện được tính theo công thức.
a
SD
LOD


3

15
Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn của đáp ứng

16
CHƯƠNG 2.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.1.1. Dược liệu
Dược liệu: cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli ) trồng ở tỉnh Hà Giang.
- Phụ tử lấy khi cây đã ra quả và lụi, rửa sạch, phơi sấy khô, nghiền thành bột kích
thước khoảng 1mm.
- Lá tươi cây ô đầu, lấy khi cây đã ra quả phơi sấy khô, xay nhỏ kích thước 2-5
mm.
2.1.1.2. Hóa chất, dung môi
- Chất đối chiếu :
+ Chất chuẩn PTN quercetin hàm lượng 99,0%
+ Chất chuẩn PTN glucose hàm lượng 98,6%.
- Dung môi, hóa chất:
+ EtOH 96
0
, đạt tiêu chuẩn PA.
+ H
2
SO
4
đặc, đạt tiêu chuẩn PA.
+ Phenol , đạt tiêu chuẩn PA.
+ AlCl