BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU TIẾN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN
TRONG VIÊN PHÓNG THÍCH CÓ KIỂM SOÁT
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


Nguyễn Thị Kiều Anh và ThS. Đinh Thị Hải Bình, những ngƣời Thầy đã
trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn thành
luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân
tích và tƣơng đƣơng sinh học - Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn này.
Xin gởi lời biết ơn tới Ban giám hiệu trƣờng đại học dƣợc Hà Nội, các
Thầy Cô đã trực tiếp tham gia giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, những ngƣời
luôn sát cánh động viên, ủng hộ giúp tôi hoàn thành khóa học và luận văn
tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2013
Học viên
Nguyễn Hữu Tiến

MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng, biểu
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng I: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN 3
1.1.1. Tổng quan về Pseudoephedrin (PSE) 3
1.1.2.Tổng quan về Loratadin (LOR) 8
1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng đồng thời PSE và LOR 12

3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 37
3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 44
3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống 44
3.3.2. Độ chọn lọc 45
3.3.3. Độ tuyến tính 48
3.3.4. Độ chính xác 49
3.3.5. Độ đúng 52
3.4. ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỘT
SỐ TIÊU CHÍ CỦA VIÊN VN_CLARINASE 54
3.4.1. Độ đồng đều hàm lƣợng 54
3.4.2. Định lƣợng 55
3.4.3. Độ hòa tan 57
3.4.4. Đánh giá giải phóng hoạt chất in vitro viên phóng thích có kiểm soát
chứa PSE và LOR 57
Chƣơng 4. BÀN LUẬN 66
4.1. Về phƣơng pháp HPLC 66
4.2. Về thẩm định phƣơng pháp phân tích 68
4.3. Về ứng dụng của phƣơng pháp phân tích 70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72
Kết luận 72
Kiến nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN
Acetonitril
AHP
Amoni dihydrophosphat
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

1.1
Một số nghiên cứu định lƣợng PSE bằng HPLC
6
1.2
Một số nghiên cứu định lƣợng LOR bằng HPLC
10
1.3
Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời PSE và LOR
bằng HPLC
13
2.1
Yêu cầu về độ hòa tan của chế phẩm Clatadin B
30
3.1
Khảo sát chế độ đẳng dòng
39
3.2
Chƣơng trình dung môi sắc ký
41
3.3
Chƣơng trình tốc độ dòng
43
3.4
Kết quả độ thích hợp hệ thống sắc ký của PSE và LOR
45
3.5
Kết quả khảo sát độ tuyến tính của PSE và LOR
48
3.6
Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp

3.15
Kết quả đánh giá độ hòa tan in vitro của chế phẩm đối
chiếu Clarinase ở pH 4,5
61
3.16
Kết quả đánh giá độ hòa tan in vitro của chế phẩm thử
Clatadin B ở pH 6,8
62
3.17
Kết quả đánh giá độ hòa tan in vitro của chế phẩm đối
chiếu Clarinase ở pH 6,8
63
3.18
Kết quả đánh giá hệ số tƣơng đồng f
2

65

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình
Nội dung
Trang
3.1
Sắc ký đồ khảo sát loại cột sắc ký
38
3.2
Đồ thị biễu diễn sự thay đổi thời gian lƣu của píc PSE và
LOR khi thay đổi tỷ lệ pha động
40

của viên thử (T) và viên đối chiếu (R) ở pH 6,8
65

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm mũi dị ứng là bệnh lý khá phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới gió mùa
hay nƣớc có nền công nghiệp đang phát triển do môi trƣờng ô nhiễm có nhiều
kháng nguyên lạ nhƣ ở Việt Nam. Việc phối hợp nhiều hoạt chất trong điều
trị cho thấy hiệu quả rõ rệt và cải thiện đáng kể các triệu chứng của viêm mũi
dị ứng. Loratadin là một thuốc kháng histamin thế hệ II có tác dụng làm giảm
triệu chứng của viêm mũi dị ứng do giải phóng histamin, pseudoephedrin là
một chất có tác dụng co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu. Việc kết hợp 2
chất này trong một dạng bào chế đem lại tác dụng chữa viêm mũi dị ứng hiệu
quả. Tuy nhiên, sự khác biệt về độ tan và thời gian bán thải của hai dƣợc chất
này khác nhau đáng kể nên bào chế dạng quy ƣớc có hiệu quả không cao.
Trên thị trƣờng hiện có một số chế phẩm Claritin-D, Clarinase là sản phẩm
của nƣớc ngoài (Schering-Plough) đƣợc bào chế ở dạng viên giải phóng có
kiểm soát. Đề tài nghiên cứu Khoa học và Công nghệ cấp bộ “ Nghiên cứu
bào chế và đánh giá sinh khả dụng viên phóng thích có kiểm soát chứa
Pseudoephedrin và Loratadin ” đã nghiên cứu sản xuất thành công dạng bào
chế nói trên với tên gọi Clatadin B. Do đó việc nghiên cứu xây dựng một tiêu
chuẩn chất lƣợng cho sản phẩm bào chế mới này là rất cần thiết.
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một trong những phƣơng
pháp đƣợc sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm dƣợc phẩm. Phƣơng pháp
này cho phép vừa tách, định tính, định lƣợng đồng thời chất phân tích trong
cùng một phép thử với độ chọn lọc và chính xác cao nên thƣờng đƣợc xem là
phƣơng pháp “trọng tài” khi cần đánh giá các phƣơng pháp khác.
Để góp phần tiêu chuẩn hóa chế phẩm viên bao Clatadin B, đặc biệt là có
một phƣơng pháp định lƣợng đồng thời pseudoephedrin và loratadin với thời
gian ngắn, độ chính xác cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng

H
15
NO)
2
.H
2
SO
4
, khối lƣợng phân tử 428,54). [15], [16], [38]
1.1.1.2. Tính chất vật lý – hóa lý
- Cảm quan: Tinh thể trắng, không màu hoặc gần nhƣ không màu
- Tính tan: tan tự do trong nƣớc, alcohol; khó tan trong dicloromethan
- Hấp thụ UV: dung dịch PSE trong ethanol hấp thụ cực đại tại các
bƣớc sóng 208 nm, 251 nm, 237 nm và 264 nm.
- Nhiệt độ nóng chảy: 184 °C [15], [38].
1.1.1.3. Tính chất dược lý
a. Dược lực học
PSE có tác dụng giống thần kinh giao cảm gián tiếp và trực tiếp, và là
một chất làm giảm xung huyết hữu hiệu ở đƣờng hô hấp trên. PSE yếu hơn rất
4
nhiều so với ephedrin về những tác dụng làm nhịp tim nhanh, tăng huyết áp
tâm thu cũng nhƣ gây kích thích hệ thần kinh trung ƣơng [3], [12].
b. Dược động học
- Hấp thu: PSE hấp thu gần nhƣ hoàn toàn qua đƣờng tiêu hóa và không
có bằng chứng của chuyển hóa lần một qua gan. Khi uống với liều 60-120 mg
thì đạt nồng độ tối đa trong huyết tƣơng 180-300 ng/ml hoặc 397-422 ng/ml,
tƣơng ứng với thời gian khoảng 1,39-2 giờ hoặc 1,84-1,97 giờ. Hấp thu từ
dạng giải phóng kéo dài chậm hơn và đạt nồng độ cực đại sau 3,8-6,1 giờ.
Thức ăn làm chậm hấp thu thuốc khi uống dƣới dạng dung dịch nhƣng không
ảnh hƣởng khi uống dƣới dạng giải phóng kéo dài.

adrenergic.
Giảm huyết áp khi dùng kèm các thuốc nhƣ: methyldopa, reserpin,
mecamylamin hydrochlorid, veratrum alcaloid. [3], [12]
f. Liều dùng, cách dùng
- Trẻ em 2-5 tuổi: 15 mg, 3-4 lần/ngày.
- Trẻ em 6-12 tuổi: 30 mg, 3-4 lần/ngày.
- Dạng giải phóng kéo dài: ngƣời lớn: 120 mg/12 giờ hoặc 240 mg/24 giờ [3],
[12].
6
1.1.1.4. Một số phương pháp định lượng PSE
a. Phương pháp HPLC
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu định lƣợng PSE bằng HPLC
Tài
liệu
Cột sắc ký
Điều kiện
Mẫu
thử
[15]
Nucleosil
C18
(250 x 4,6
mm, 5 µm)

- Pha động: MeOH: CH
3
COONH
4
0,4% =
6:94.

(200 × 4,6
mm, 10
µm)

- Pha động: Natri dioctylsulfosuccunat
0,005M trong MeOH: H2O = 65:35.
- Detector UV-VIS: λ= 258 nm.
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20 µl.
Viên
nén quy
ƣớc
7
[26]
Hypersil
C18 (200
x 4,6mm,
5 μm)
-Pha động : dd đệm phosphat 25mM – MeOH
– ACN (30:60:10) thêm vào 100 mg acid
heptan sulphonic mỗi 100 ml
-Detector UV-VIS : λ=240 nm.
-Tốc độ dòng : 1ml/phút
-Khoảng tuyến tính : 12-72 μg/ml
Viên
nén quy
ƣớc
[33]
Cosmosil
C8 (250 x

- Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 10 µl
Viên
nén quy
ƣớc
b. Các phương pháp khác
Pseudoephedrin còn đƣợc định lƣợng bằng các phƣơng pháp:
- Chuẩn độ acid – base trong môi trƣờng khan với dung dịch HClO
4
0,1M (đối với nguyên liệu) [15], [38]
8
- Quang phổ đạo hàm (đối với dạng viên nén) [36]
- Quang phổ huỳnh quang thông qua dẫn xuất với 4-cloro-7-
nitrobenzofurazan (đối với các dạng viên nén, viên nang, siro) [13]
1.1.2. Tổng quan về Loratadin
1.1.2.1. Cấu tạo hóa học
- Công thức cấu tạo:
- Công thức phân tử: C
22
H
23
ClN
2
O
2

- Khối lƣợng phân tử: 328,88
- Tên khoa học: Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H
benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-yliden) -1-piperidinecarboxylat
[38]

b. Dược động học
- Hấp thu: LOR hấp thu nhanh sau khi uống. Nồng độ đỉnh trong huyết
tƣơng trung bình của LOR và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó
(descarboethoxyloratadin) tƣơng ứng là 1,5 và 3,7 giờ. 97% LOR liên kết với
protein huyết tƣơng. Sau khi uống LOR, tác dụng kháng histamin của thuốc
xuất hiện trong vòng 1 - 4 giờ, đạt tối đa sau 8 - 12 giờ, và kéo dài hơn 24 giờ.
Nồng độ của LOR và descarboethoxyloratadin đạt trạng thái ổn định ở phần
lớn ngƣời bệnh vào khoảng ngày thứ năm dùng thuốc.
10
- Phân bố: Ở liều điều trị thuốc không qua hàng rào máu não nên không
phân bố vào não.Thể tích phân bố của thuốc là 80 - 120 lít/kg.
- Chuyển hóa: LOR chuyển hóa nhiều khi qua gan lần đầu bởi hệ enzym
microsom cytochrom P450; LOR chủ yếu chuyển hóa thành
descarboethoxyloratadin, là chất chuyển hóa có tác dụng dƣợc lý.
- Thải trừ: Khoảng 80% tổng liều của LOR bài tiết ra nƣớc tiểu và phân
ngang nhau, dƣới dạng chất chuyển hóa, trong vòng 10 ngày. Nửa đời của
LOR là 17 giờ và của descarboethoxyloratadin là 19 giờ. Nửa đời của thuốc
biến đổi nhiều giữa các cá thể, không bị ảnh hƣởng bởi urê máu, tăng lên ở
ngƣời cao tuổi và ngƣời xơ gan. [2], [3], [12]
1.1.2.4. Một số phương pháp định lượng LOR
a. Phương pháp HPLC
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lƣợng LOR bằng HPLC
Tài
liệu
Cột sắc ký
Điều kiện
Mẫu thử
[15]
Inertsil ODS-3V
( 250 x 4,6 mm,

-Detector UV-VIS : λ=220 nm.
-Tốc độ dòng : 1ml/phút
-Thể tích tiêm : 50μl
[25]
Hypersil C8
BDS (150× 4,6
mm, 5 µm)
- Pha động: K
2
HPO
4
(0,01M, pH 7,2):
MeOH: ACN = 7:6:6.
- Bƣớc sóng phát hiện: λ = 280 nm.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 15 µl.
Viên
nhai
[30]
Cột C8 (150 x
4,6 mm, 5 μm)
-Pha động : Đệm phosphat 0,1M:
Methanol : Acetonitril (1:2:1)
-Detector UV-VIS : λ=254 nm.
-Tốc độ dòng : 1 ml/phút
-Thể tích tiêm : 20 μl
Viên nén
quy ƣớc
[31]
SymmetryShield

-LOQ : 0,10 ng/ml
Huyết
tƣơng
[38]
Cột Zorbax C8
RX (150× 4,6
mm, 5 µm ) - Pha động: K
2
HPO
4
(0,01M, pH 7,2):
MeOH: ACN = 7:6:6.
- Thể tích tiêm: 15 µl.
- Tốc độ dòng:1 ml/phút.
- Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm.
Viên nén
quy ƣớc
b. Các phương pháp khác
Loratadin còn đƣợc định lƣợng bằng các phƣơng pháp :
- Chuẩn độ acid-base trong môi trƣờng khan với dung dịch HClO
4
0,1M
(đối với dạng nguyên liệu) [15].
- Điện di mao quản ( đối với dạng viên nén) [29].
- Phƣơng pháp cực phổ (đối với dạng viên nén) [35].
1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng đồng thời PSE và LOR
a. Phương pháp HPLC

cột Tracer
Extrasil CN
(150 x 4,6
mm, 5 µm)
-Pha động : ACN : NH
4
H
2
PO
4
10 mM
(80 : 20) (tt/tt)
-Detector UV-VIS : λ = 250 nm.
-Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút
- Khoảng tuyến tính: 0,1-100 μg/ml
(LOR) và 10-600 μg/ml (PSE)
Viên giải
phóng
kéo dài
[27]
BondaPak
C18 (300 ×
3,9 mm, 10
µm)
-Pha động : hỗn hợp H
2
O: MeOH:
H
3
PO

- Thể tích tiêm: 20 µl
- Khoảng tuyến tính: 10-50 μg/ml (LOR)
và 200-1000 μg/ml (PSE)
Viên nén
quy ƣớc
b. Các phương pháp khác
Bên cạnh phƣơng pháp HPLC, M.M. Mabrouk và cộng sự cũng tiến
hành định lƣợng các chế phẩm chứa đồng thời LOR và PSE bằng phƣơng
pháp quang phổ đạo hàm. Khoảng nồng độ tuyến tính là 5-25 μg/ml đối với
LOR và 240-720 μg/ml đối với PSE.sulfat [27].
Tƣơng tự, Singhvi I. và Bhatia N. đã nghiên cứu định lƣợng đồng thời
PSE và LOR bằng phƣơng pháp đo quang tại nhiều bƣớc sóng (257 nm và
283 nm) và phƣơng pháp pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất. [34]
Feyyaz Onur và cộng sự đã tiến hành định lƣợng đồng thời PSE.sulfat,
LOR và dexbrompheniramin maleat trong viên nén theo phƣơng pháp quang
phổ đạo hàm và quang phổ đạo hàm tỷ đối. Khoảng nồng độ tuyến tính trong
cả hai phƣơng pháp là 5 - 40 μg/ml đối với LOR và 192 - 1152 μg/ml đối với
PSE [17].
Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thanh
Hải đã nghiên cứu định lƣợng đồng thời LOR và PSE.sulfat bằng phƣơng
pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất. Khoảng tuyến tính khảo sát với LOR là 5-
50 μg/ml và của PSE.sulfat là 180-1000 μg/ml [10].
15
Lê Minh Trí và cộng sự đã xây dựng phƣơng pháp quang phổ đạo hàm
để định lƣợng PSE.sulfat và LOR trong viên nén. Khoảng tuyến tính khảo sát
với LOR là 15 - 35 μg/ml và của PSE.sulfat là 36 - 84 μg/ml [11].
1.2. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.2.1. Nguyên tắc và phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các