BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HIỀN
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT
ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HIỀN
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT
ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Ths.Nguyễn Trung Hiếu
2.Ths. Bùi Đình Sơn
Nơi thực hiện:
Bảng 3 Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của
các dẫn chất Benzen
12
Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21
Bảng 3.1 Kết quả về cường độ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong
HCl ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm 30 phút
28
Bảng 3.2 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR
10mg/L trong HCl 9M, ở nhiệt độ 21-23
0
C , Δλ=30nm tại các
thời điểm khảo sát
30
Bảng 3.3 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR
10mg/L trong HCl 9M ở các nhiệt độ khác nhau tại các thời
điểm khảo sát.
32
Bảng 3.4 Kết quả về cường độ huỳnh quang của các dung dịch dẫn
xuất AZTR ở các Δλ khác nhau tại thời điểm 30 phút.
35
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 37
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ chính xác. 40
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 42
Bảng 3.8 Kết quả định lượng một số chế phẩm chứa AZTR trên thị
trường
44
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.
MeOH : Methanol.
AZTR : Azithromycin.
26
Hình 3.3 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HNO
3
9M,
Δλ=30nm, t=21-23
0
C, tại thời điểm 30 phút
26
Hình 3.4 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 7M,
Δλ=30nm t=21-23
0
C tại thời điểm 30 phút
28
Hình 3.5 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 5M,
Δλ=30nm t=21-23
0
C tại thời điểm 30 phút
28
Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng nồng độ acid HCl lên cường độ
huỳnh quang của dẫn xuất AZTR
29
Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tạo dẫn xuất lên
cường độ huỳnh quang của dẫn xuất AZTR
30
Hình 3.8 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,
t=40
0
C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút
31
Hình 3.9 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,
-
λ
ex
lên cường độ
huỳnh quang của dung dịch AZTR ở các nồng độ khác nhau trong
HCl 9M.
35
Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và cường
độ huỳnh quang của dung dịch AZTR trong HCl 9M.
38
1
ĐẶT VẤN ĐỀ.
Năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra và sau đó phân tách được
penicillin đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc điều trị các bệnh nhiễm
trùng, mà trước đó được coi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử
vong trên thế giới đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển trong đó có
Việt Nam. Trong suốt những thập kỷ tiếp theo và cho đến tận ngày nay cùng
với sự phát triển của khoa học - kỹ thuật nhiều kháng sinh mới đã được tìm
ra và cho hiệu quả điều trị ngày càng cao. Trong đó có Azithromycin (1980)
là một kháng sinh macrolid bán tổng hợp được sử dụng để điều trị các loại
nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn đường hô hấp, da, đường tiêu hóa, đường
sinh dục, đặc biệt AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn nội bào, các vi khuẩn
cơ hội ở bệnh nhân bị nhiễm HIV [4], [15]. Hiện nay trên thị trường dược
phẩm Việt Nam có nhiều loại biệt dược chứa AZTR có xuất xứ khác nhau cả
trong và ngoài nước. Để kiểm tra, kiểm soát , đảm bảo chất lượng của từng
loại biệt dược đang lưu hành trên thị trường và để việc sử dụng được đúng
liều, đảm bảo hiệu quả điều trị thì công tác kiểm nghiệm định lượng AZTR
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ AZITHROMYCIN (AZTR).
1.1.1. Công thức cấu tạo [5]
- Công thức phân tử: C
38
H
72
N
2
O
12
- Khối lượng phân tử: 748,98
- Tên khoa học : 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA
1.1.2.Tính chất vật lý và hóa học
Tính chất vật lý [4],[5]
- Bột kết tinh màu trắng đến trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng
- Thực tế không tan trong nước rất dễ tan trong methanol, ethanol,
methylen clorid, aceton, chloroform, dung dịch acid hydroclorid loãng…
- Năng suất quay cực từ -45
0
đến -49
- Một lượng nhỏ AZTR bị khử metyl trong gan, được đào thải qua mật ở
dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa.
- Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72h ở dạng
không biến đổi.
1.1.4. Cơ chế tác dụng [4]
- AZTR tác động bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom ở vi
khuẩn và qua đó ngăn cản quá trình tổng hợp protein của chúng.
1.1.5.Tác dụng dƣợc lý (phổ tác dụng) [4], [15]
- Là một kháng sinh có hoạt phổ rộng thuộc nhóm Macrolid, được gọi là
azalid. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn mạnh.
- Có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram(+) như: Streptococcus,
Pneumococcus, Staphylococcus aureus….
5
- Một số chủng vi khuẩn khác cũng rất nhạy cảm với AZTR như
Corynebacterium diphteriae, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus,
Propionibacterium acnes…
- AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn Gr(-) như Haemophilus influenza,
Neissria gonorrhoeae, Legionella pneumophilia…Và có tác dụng vừa phải
trên các vi khuẩn Gr(-) như Escheria coli, Salmonella enteritidis, Salmonella
typhi, Klebsiella spp….
- Nhìn chung AZTR tác dụng trên vi khuẩn Gr(+) yếu hơn 1 chút so với
Erythromycin nhưng lại mạnh hơn trên 1 số vi khuẩn Gr(-) trong đó có
Haemophilus.
1.1.6.Tác dụng không mong muốn.[4]
- AZTR dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp. Hay gặp
nhất là chứng rối loạn tiêu hóa (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn
nôn, đau bụng, nôn, ỉa chảy, đầy hơi, nhưng thường nhẹ và ít xảy ra hơn
Erythromycin.
- AZTR gây ảnh hưởng trên thính giác: Sử dụng lâu dài AZTR ở liều cao
500mg
- Viên nén và viên nén bao phim AZTR 125mg, 250mg, 500mg.
- Viên nén phân tán tương đương AZTR 100mg
- Bột pha hỗn dịch uống AZTR dạng dihydrat tương đương 200mg
AZTR/ 5ml
- Lọ bột đông khô pha tiêm 500mg. 7
1.1.11. Một số chế phẩm chứa AZTR lƣu hành trên thị trƣờng [10]
Bảng 1.Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường.
STT
Tên chế phẩm
Dạng bào chế
Hàm
lượng
Hãng sản xuất
1
Azicine
Viên nang
Gói bột uống
250mg
Công ty TNHH LD
STADA Việt Nam
2
Zitromax
Zithromax IV
Viên nén
Bột pha tiêm tĩnh
250mg
500mg
Mekophar
8
Azibiotic
Viên nén bao phim
500mg
Tenamyd
Canada
9
Medpro-
Azithromycin
Viên nén
500mg
Cipla Medpro
10
Cipla-
Azithromycin
Bột pha tiêm
500mg
Cipla Medpro
11
Azimon
Viên nén
500mg
Monicopharma
12
Azicern
Viên nén
250mg
4
Detector
Quang phổ tử ngoại đặt ở
bước sóng 215nm
Quang phổ tử ngoại đặt ở bước
sóng 215nm
Thể tích tiêm
20µL
20µL
Tốc độ dòng
1.5mL/ phút
1.5mL/phút
Chuẩn bị
dung dịch
mẫu và
chuẩn
Được pha ở nồng độ
khoảng 1mg/mL trong
pha động
Được pha ở nồng độ khoảng
2mg/mL trong pha động
9 Phƣơng pháp vi sinh vật [9], [13]
- Khuếch tán trên thạch,nuôi cấy và chế tạo nhũ dịch, đo đường kính
vòng vô khuẩn, có thể dùng các vi khuẩn chỉ thị: Bacillus pumilus NCTC (B)
63202, Bacilus pumilus NCTC 8241 , Micrococcus luteus ATCC 9341.[9]
- Xác định hoạt lực của azithromycin trong dung dịch ophthalmic .Pha
: cường độ của bức xạ kích thích
: hiệu suất huỳnh quang = Số photon phát xạ : Số photon hấp thụ
(0 < <1)
hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích.
Rút gọn lại ta có: F= K’ . C với K’= K . I
0
. . L
Chú ý: Việc đo phổ huỳnh quang chỉ nên tiến hành với dung dịch loãng
C < 10
-4
M
để tránh ảnh hưởng suy giảm cường độ của bức xạ phát ra.
1.2.1.2.Đặc điểm của huỳnh quang [1]
- Thời gian huỳnh quang rất ngắn chỉ khoảng 10
-9
giây và sự huỳnh
quang là đa hướng.
- Hiệu suất huỳnh quang là một đặc trưng vật lí cho biết khả năng huỳnh
quang của một chất và được tính bằng tỷ số giữa số photon phát xạ và số
photon hấp thụ.
- Cường độ huỳnh quang là hiệu suất thực nghiệm hoạt tính phát huỳnh
quang của một chất khi nó được kích thích do được hấp thụ một bức xạ thích
hợp. Cường độ huỳnh quang tỷ lệ với cường độ bức xạ kích thích, hiệu suất
huỳnh quang và nồng độ chất phát huỳnh quang.
- Vì huỳnh quang đa hướng nên cường độ huỳnh quang đo dược chỉ là
một phần của cường độ huỳnh quang và người ta thường đo theo phương
vuông góc với chùm tia kích thích.
- Nói chung cường độ huỳnh quang phụ thuộc tuyến tính với nồng độ ở
vùng nồng độ thấp. Sự tuyến tính mất đi khi độ truyền qua chỉ còn dưới 90%
vòng như quinolin, isoquinolin, indol…lại thường có huỳnh quang.
- Các nhóm thế trên vòng thơm có thể gây ra sự dịch chuyển bước sóng
cực đại kích thích và thay đổi tương ứng các pic trong phổ huỳnh quang. 12
Bảng 3. Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của các dẫn
chất Benzen
Hợp chất
Cường độ
huỳnh quang
tương đối
Hợp chất
Cường độ
huỳnh quang
tương đối
Benzen
10
Ion phenolat
10
Toluen
17
Anisol
20
Fluorobenzen
10
Anilin
20
Chlorobenzen
2
, alkyl, aryl….làm tăng
hiệu suất huỳnh quang.
Ngược lại những nhóm hút huỳnh quang như: NO
2
, -COOH, Cl,
Br….lại làm giảm hiệu suất huỳnh quang.
Các yếu tố về môi trƣờng [1]
- Nhiệt độ và dung môi là 2 yếu tố có ảnh hưởng đến huỳnh quang. Hầu
hết với các phân tử hiệu suất huỳnh quang giảm khi nhiệt độ tăng bởi vì khi
đó tần suất va chạm tăng lên và sự hồi phục do va chạm dễ dàng xảy ra.
- Việc giảm độ nhớt của dung môi cũng cho kết quả tương tự.
1.2.1.4. Máy quang phổ huỳnh quang.[1], [2]
Bé ®¬n s¾c
kÝch thÝch
Bé ®¬n s¾c
huúnh quang
Nguån s¸ng
G-¬ng
Hình 1. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang - Tăng cường độ huỳnh
quang bằng hệ thống gương.
Cấu tạo máy.
- Nguồn sáng trong máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo ra các
bức xạ kích thích cần thiết. Nguồn sáng thường dùng là đền xeon có khả năng
phát ra bức xạ trong khoảng rộng 200-800nm nhưng phổ bức xạ không đều
các tia UV mạnh hơn các tia VIS. Ngoài ra còn dùng nguồn cảm ứng laser,
đền xeon kém nhạy hơn laser.
- Bộ phận đơn sắc hóa gồm 2 phần đơn sắc hóa bức xạ kích thích và đơn
sắc hóa bức xạ huỳnh quang.Hai bộ phận này bố trí trước và sau buồng đo. Sử
Phương pháp gián tiếp dựa trên sự giảm hay tắt huỳnh quang của
tác nhân do sự phản ứng của nó với chất phân tích. Sự tắt huỳnh quang đầu
tiên được sử dụng để phát hiện các anion.
- Để xác định các cation, tác nhân sử dụng để đo huỳnh quang chủ yếu là
các hợp chất thơm có 2 hay nhiều nhóm cho khả năng huỳnh quang mà cho
phản ứng tạo phức với ion kim loại như 8-hydroxyquinolin.Với hầu hết tác
nhân này cation được chiết vào dung dịch của tác nhân trong CHCl
3
trước khi
đo huỳnh quang.
- Đối với hợp chất hữu cơ và hóa sinh: Phương pháp huỳnh quang có
ứng dụng quan trọng trong phân tích thực phẩm, dược phẩm, mẫu bệnh phẩm,
các hợp chất tự nhiên nhờ độ nhậy và chọn lọc của phương pháp.
Nhiều nghiên cứu tiến hành với các chất hữu cơ như Adenin,
Cystein, Indol, Tryptophan…
Các thuốc như Adrenalin, Penicillin, Phenobarbital, Procain,….
Với các Enzym, coenzyme và các hợp chất tự nhiên như các
Alkaloid, Flavonoid,…
Một số phƣơng pháp dùng trong định lƣợng bằng huỳnh quang.
Nguyên tắc của các phương pháp định lượng: Nồng độ của chất phân
tích tỷ lệ với cường độ huỳnh quang.
Trong khuôn khổ của khóa luận này chúng tôi xin trình bày cụ thể 3
phương pháp định lượng bằng huỳnh quang là: Phương pháp so sánh, phương
pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn.
Phƣơng pháp so sánh .
- Mẫu thử luôn luôn được so sánh với mẫu chuẩn
- Kiểm tra vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang và điều chỉnh độ
nhạy của thiết bị với độ pha loãng thích hợp của dung dịch chuẩn.
16
OX
và I
OS
: trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng.
Vùng trong đó cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của chất
thường rất hẹp, cho nên tỉ số (I
X
– I
OX
) / ( I
S
– I
OS
) phải không được < 0,5 và
không >2,0. Nếu tỉ số không nằm trong khoảng trên thì phải điều chỉnh nồng
độ và tiến hành đo lại.
Phƣơng pháp đƣờng chuẩn.
Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến
hành quét đồng bộ phổ huỳnh quang. Đáp ứng thu được là cường độ huỳnh
quang. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa cường độ huỳnh quang và
nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đồ thị để tính toán nông
độ của chất cần phân tích theo 2 cách:
- Áp dữ kiện cường độ huỳnh quang của chất thử vào đường chuẩn sẽ
suy ra được nồng độ của nó.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa cường
độ huỳnh quang với nồng độ chất cần phân tích.
Y = aC
x
+ b
Trong đó:
1.2.2. Quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]
1.2.2.1.Khái niệm về quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]
Trong huỳnh quang thông thường phổ phát xạ thu được bằng cách quét
các phát xạ đơn sắc ở các bước sóng phát xạ khác nhau, giữ đơn sác kích
thích ở 1 bước sóng cụ thể.
Còn phổ kích thích thu được bằng cách quét các đơn sắc kích thích ở các
bước sóng kích thích khác nhau, giữ đơn sắc phát xạ không đổi ở 1 bước sóng
cụ thể.
Khi quét cả 2 đơn sắc cùng lúc được gọi là quét đồng bộ phổ huỳnh
quang
Nếu tốc độ quét là hằng số cho cả 2 đơn sắc kích thích và phát xạ và
=
em
-
ex
được giữ cố định thì được gọi là kỹ thuật liên tục bước sóng.
Đây là kĩ thuật đơn giản và được sử dụng thường xuyên nhất trong các chế
độ đồng bộ. Vì vậy nói chung quét đồng bộ phổ huỳnh quang đề cập đến kỹ
thuật này.
1.2.2.2.Đặc điểm của quét đồng bộ phổ huỳnh quang [14]
- Thu hẹp dải quang phổ: Tác động này chủ yếu là kết quả của việc đồng
thời tăng hoặc giảm cường độ huỳnh quang
- Đơn giản hóa phổ phát xạ :Trong phổ huỳnh quang thông thường tại 1
bước sóng kích thích cố định (
ex
) nó có thể tăng cường độ của tất cả dải phổ
cùng một lúc. Nhưng quét đồng bộ cho phép pic có cường độ cao nhất được
tăng lên một cách chọn lọc nếu sử dụng một phù hợp.
- Co phạm vi quang phổ: trong một phân tích có thể không quan tâm đến
F
2
…… F
9
.
Copyright: Tài liệu đại học ©