BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ PHƯƠNG NGÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG METOPROLOL TRONG CHẾ
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
QUANG PHỔ HUỲNH QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ PHƯƠNG NGÂN


trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chị kỹ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi về máy móc, trang thiết bị, cơ sở vật chất cũng như hóa chất,
dụng cụ trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài.
Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, các thầy
cô Phòng Đào tạo và các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã hướng dẫn,
cho tôi kiến thức của 5 năm chương trình đào tạo Dược sỹ Đại học để tôi có thể
hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn Bố mẹ và những người thân trong gia
đình tôi, cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn động viên, cổ vũ để tôi hoàn thành tốt
khóa luận của mình.

Hà Nội, tháng 05, năm 2014
Sinh viên Lê Phương Ngân MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Metoprolol tartrat 2
1.1.1. Công thức cấu tạo 2

3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng metoprolol tartrat bằng quang
phổ huỳnh quang ………………… ……………………………… ….23
3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng metoprolol tartrat 25
3.1.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ huỳnh quang để định lượng
trong chế phẩm ……………………………….………….………… 34
3.2. Bàn luận 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
UV – Vis (Utraviolet – Visble): Tử ngoại – khả kiến
Q (Quencher): Chất làm tắt hóa học
SĐK: Số đăng kí
BQ: Bảo quản
NSX: Ngày sản xuất
NXB: Nhà xuất bản

nén………………………………………………………………………… 36 DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của metoprolol tartrat…………………… … 2
Hình 1.2. Phổ huỳnh quang của vitamin B
1
………………………………… 9
Hình 1.3. Phổ huỳnh quang của Natri salicylat………………………… 9
Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang…………………… 13
Hình 3.1. Phổ phát xạ của metoprolol tartrat nồng độ 2000ng/ml………… 24
Hình 3.2. Phổ kích thích của metoprolol tartrat 2000ng/ml…………………25
Hình 3.3. Phổ kích thích của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng
độ khoảng 2000ng/ml……………… ………………………………… 26
Hình 3.4. Phổ phát xạ của chất thử và chất chuẩn metoprolol tartrat nồng độ
khoảng 2000ng/ml ………………………………………………………… 26
Hình 3.5. Đường hồi quy tuyến tính của metoprolol tartrat……………… 28
Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn metoprolol tartrat 500µg/ml……… 32
Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch thử metoprolol tartrat khoảng 500µg/ml… 32


- Ứng dụng phương pháp để định lượng metoprolol tartrat trong chế phẩm.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Metoprolol tartrat
1.1.1. Công thức cấu tạo [19]
O
CH
3
O NH CH
3
CH
3
H
OH
2

H OH
CO
2
H
OH
H
CO
2
H


mg, 100mg, 200mg metoprolol tartrat, metoprolol succinat.
Ống tiêm (metoprolol tartrat) 5mg/5 ml. Mỗi ống tiêm chứa 45mg natri
clorid.
1.1.2.2. Dược động học
Sau khi uống, metoprolol tartrat được hấp thụ gần như hoàn toàn, nhưng
khả dụng sinh học tương đối thấp (khoảng) do sự chuyển hóa ban đầu.
Nồng độ của thuốc trong huyết tương thay đổi trong phạm vi rộng (tới 17 lần),
3

có lẽ do những khác biệt di truyền trong tốc độ chuyển hóa. Metoprolol chuyển
hóa mạnh bởi hệ thống monooxygenase ở gan, và chỉ  thuốc đã uống được
đào thải dưới dạng không biến đổi trong nước tiểu. Nửa đời của metoprolol từ
3 đến 4 giờ.
1.1.2.3. Tác dụng
- Metoprolol là một thuốc đối kháng chọn lọc beta1 - adrenergic không có
hoạt tính nội tại giống thần kinh giao cảm. Tuy nhiên tác dụng không tuyệt
đối trên thụ thể beta1 - adrenergic nằm chủ yếu ở cơ tim và metoprolol khi
dùng liều cao cũng ức chế cả thụ thể beta2 - adrenergic nằm chủ yếu ở hệ
cơ phế quản và mạch máu.
- Metoprolol không có những tính chất chủ vận - beta, và có rất ít tác dụng ổn
định màng. Thuốc có tác dụng giảm lực co cơ và nhịp tim.
1.1.2.4. Chỉ định
- Tăng huyết áp
- Đau thắt ngực
- Phòng ngừa nhồi máu cơ tim
- Loạn nhịp tim
- Suy tim trung bình hay nhẹ
1.1.2.5. Độ ổn định và bảo quản
- Bảo quản viên nén metoprolol ở nhiệt độ 15 – 30
°
Định lượng đồng thời metoprolol tatrat và
hydroclothiazid trong chế phẩm:
Pha động: acid phosphoric 0,5%: methanol
: acetonitril = 35 : 15 : 50
Cột: LiChrosorb C18 10µm, 250mm ×
4,6mm
Tốc độ dòng: 1ml/phút
Detector: 280nm
[17]
Định lượng metoprolol tartrat trong chế
phẩm:
Tạo dẫn xuất trước cột bởi metoprolol
tartrat và phức Cu (II) – dithiocarbamat
Pha động: methanol : đệm phosphat pH 5,8
= 80 : 20
Cột: C18 10µm; 3,5nm×300nm

Tạo dẫn xuất metoprolol tartrat với
N- Methyl- N- trifloroacetamid
Pha động: ethylacetat : diethylether =
2 : 1 (tt/tt)
Cột: HP-5 MS 0,25µm, 30m × 0,25mm
Tốc độ dòng: 1ml/phút
[8]

1.2. Phương pháp huỳnh quang
1.2.1. Hiện tượng huỳnh quang [5],[6]
Một chất khi hấp thụ năng lượng ở giới hạn nào đó sẽ làm kích thích hệ
electron của phân tử. Ở trạng thái kích thích phân tử chỉ tồn tại 10
-8
giây, nó lập
tức trở về trạng thái cơ bản ban đầu và giải tỏa năng lượng dưới dạng ánh sáng,
hiện tượng này gọi là phát quang. Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại
hoặc phần có bước sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tượng phát
quang quang học hay còn gọi là huỳnh quang.
6

1.2.2. Sự tạo thành phổ huỳnh quang – Cơ chế của sự phát quang [2],[5],[6]
Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (ion, nguyên tử, phân tử) có một hệ
thống duy nhất các trạng thái năng lượng. Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi
là trạng thái cơ bản (S
0
). Khi bị kích thích, như được hấp thụ photon ánh sáng
thì năng lượng của photon sẽ được truyền sang hạt và hạt sẽ được chuyển sang
năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích S
1
, S

1
,

rồi mới từ T
1

chuyển về S
0
và bức xạ các photon ánh sáng làm cho quá trình phát quang
xảy ra chậm gọi là huỳnh quang chậm hoặc lân quang (10
-3
 10 giây).
Trong hiện tượng phát quang, một phần năng lượng của ánh sáng kích
thích bị tiêu tốn chuyển thành nhiệt năng do hiện tượng bất hoạt vì vậy năng
lượng ánh sáng kích thích bao giờ cũng lớn hơn năng lượng ánh sáng phát xạ,
hay nói cách khác bước sóng của ánh sáng bức xạ luôn dài hơn bước sóng của
ánh sáng kích thích, tạo ra sự dịch chuyển cực đại phát quang về phía bước
7

sóng dài hơn so với cực đại hấp thụ, gọi là sự dịch chuyển Stock. Chất nào có
độ dịch chuyển Stock càng lớn thì phép đo huỳnh quang càng chính xác (vì ít
bị ảnh hưởng của phổ hấp thụ).
1.2.3. Cường độ huỳnh quang [2], [5]
Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia
tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn
thấy có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào
hàm lượng của chúng.
Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc chứa photon có năng
lượng ứng với hiệu năng lượng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một phần của
cường độ bức xạ tới I




Thế phương trình (1.2) vào phương trình (1.1) ta được:





  







Phương trình (1.3) có thể triển khai thành chuỗi Taylor cho kết quả là:













: Nồng độ chất phát quang trong dung dịch (mol/l)
Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là, có độ hấp thụ nhỏ εlC <
0,01) thì cường độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân
tích và với cuờng độ bức xạ tới 

. Đây là cơ sở của phương pháp huỳnh quang
phân tử dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cường độ huỳnh quang


. Nếu dung dịch C có nồng độ lớn hơn (εlC > 0,01), thì sẽ xảy ra sự tắt huỳnh
quang, không còn sự tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang nữa.
1.2.4. Phổ huỳnh quang [2], [5]
- Phổ kích thích
Là đường biễu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối theo
bước sóng của ánh sáng kích thích.
- Phổ phát xạ
Là đường biễu diễn sự phụ thuộc cường độ phát quang tương đối (cường độ
huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa) theo bước sóng của ánh sáng phát xạ.
- Ví dụ:
9 Hình 1.2. Phổ huỳnh quang của vitamin 

.

(Cực đại kích thích và phát xạ là 370nm, 425nm)
- Lưu ý
Khi ghi phổ huỳnh quang của một số chất ta thu được ngoài phổ huỳnh
quang còn một số phổ khác như ánh sáng tán xạ, của giải Raman, của dung môi

giảm.
- Đồng phân cis làm tăng phát quang và đồng phân trans làm giảm phát quang
của một hợp chất.
 Độ cứng nhắc của phân tử
Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát quang cao, và ngược
lại.
Ví dụ: Flourene, Rsamine, Flourescein: Phát quang mạnh
Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang
 Tạo dẫn chất
Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo dẫn chất
thì phát quang mạnh. Ví dụ:
11

Không phát quang
Phát quang mạnh
Tetracyclin
Tetracyclin + 

+ Barbiturat
Hydrocortison
Hydrocortison + 




đặc + Ethanol
Vitamin 


Thiocrom

là  của Quinin cho nên trong môi trường  thì Quinin
không phát quang.
 là  của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng
Acridin trong định lượng
 Nồng độ của ion 

, và vai trò của 
pH có vai trò quan trọng. Một số chất có tính acid yếu hay base yếu thì
cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH. Ví dụ:
Ta có acid AH, trong nước AH phân ly theo phương trình:
12






Nếu dạng phát quang là AH thì khi 

tăng, phản ứng theo chiều nghịch,
 tăng. Nếu dạng phát quang là 

thì  sẽ giảm trong môi trường acid và tăng
trong môi trường kiềm.
 Ảnh hưởng của dung môi
Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và
những tác động khác nhau.
Ví dụ: Sự tắt huỳnh quang hóa học do dung môi: Quininsulfat phát quang
mạnh trong môi trường 


1.2.7. Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang [2], [3]
- Định tính: Có thể dựa vào bước sóng kích thích và bước sóng huỳnh quang
để định tính các hợp chất.
- Định lượng: Do phương pháp huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao
 Có thể đo cường độ huỳnh quang và dùng phương pháp so sánh để
định lượng các hợp chất có khả năng huỳnh quang lớn.
14

 Với những chất không có huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử
không huỳnh quang để tạo ra dẫn chất có huỳnh quang hay dùng thuốc
thử có huỳnh quang để đo và sử dụng các cách xử lý thích hợp.
Ngoài ra phương pháp huỳnh quang còn được sử dụng trong bộ phận
phát hiện của sắc ký lỏng vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó, với nguồn
sáng laser có thể phát hiện tới 10
-12
g.
1.3. Phương pháp HPLC [2], [3]
1.3.1. Khái niệm
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển
của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
1.3.2. Nguyên tắc
Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất vào hai pha không trộn lẫn
nhưng luôn tiếp xúc với nhau, trong đó pha động là chất lỏng được đẩy qua pha
tĩnh trong cột nhờ bơm cao áp. Dung dịch chất cần phân tích được đưa vào hệ
thống nhờ van tiêm mẫu, được pha động kéo tới cột nhờ áp lực của bơm. Tại
cột xảy ra quá trình phân bố và tách các chất. Những chất có ái lực thấp với pha
tĩnh được rửa giải ra trước, chất có ái lực cao với pha tĩnh rửa giải ra sau. Sau
khi ra khỏi cột, các chất được detector phát hiện và ghi lại dưới dạng pic.

1.3.3.2. Thể tích lưu ( 

)
Thể tích lưu của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra
khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên
sắc kí đồ.




  
Trong đó 

: Thời gian lưu
: Lưu lượng của pha động.
1.3.3.3. Hệ số phân bố (K)
Hệ số phân bố là tỷ lệ nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ chất tan
trong pha động





 
Trong đó : Hệ số phân bố.


: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh.









Trong đó: 

, 

: lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.


,


: thể tích của pha tĩnh, pha động.
: Hệ số phân bố.
Trị số tối ưu 
1.3.3.5. Số đĩa lý thuyết (N)
 






 




a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu 
1.3.3.7. Độ phân giải (R
S
)
















Phương trình trên thích hợp cho việc tính R
S
khi hai pic tách hẳn nhau (tức
R
S
≥ 1,5).

 
 



 











  




  




trong đó: 

, 