BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
VÀ HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2014


NCS. Cao Công Khánh
HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc tới cô
giáo PGS.TS. Nguyễn Tường Vy, NCS Cao Công Khánh là những người đã trực
tiếp ở bên hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị ở labo Hóa độc thực
phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, những người đã
dìu dắt, hướng dẫn và đóng góp rất nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các anh chị của nhóm tải báo đã giúp tôi rất nhiều trong
việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các
thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện
luận văn này.
Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã
luôn ủng hộ, khích lệ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 23 tháng 8 năm 2014.
Học viên Đinh Thị Thúy Hương
MỤC LỤC

2.4.4. Thẩm định quy trình 27
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28
3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin bằng HPLC 28
3.2. Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPTLC 31
3.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32
3.4. Thẩm định phƣơng pháp 34
3.4.1. Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 34
3.4.2. Tính thích hợp hệ thống 36
3.4.3. Khoảng tuyến tính 38
3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 33
3.4.5. Độ thu hồi của phƣơng pháp 42
3.4.6. Độ lặp lại của phƣơng pháp 44
3.5. Kết quả áp dụng phƣơng pháp xác định Anthocyanin trong một số
sản phẩm 46
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 48
4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật 48
4.1.1. Lựa chọn phƣơng pháp 48
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu 48
4.1.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 50
4.1.4. Thẩm định phƣơng pháp đã xây dựng 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
KẾT LUẬN 54
KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội các nhà hóa
phân tích chính thức

Danh mục các mẫu phân tích
21
Bảng 2.2
Danh mục các pha động HPLC khảo sát
24
Bảng 2.3
Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát
25
Bảng 3.1
Gradient hệ pha động 1,2
29
Bảng 3.2
Chương trình gradient của hệ pha động, 3 và 4
30
Bảng 3.3
Kết quả định lượng Anthocyanin trong mẫu bột
Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu
33
Bảng 3.4
Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch
biberry trên HPLC
37
Bảng 3.5
Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch
Bilberry trên HPTLC
38
Bảng 3.6
Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn
cyanidin chloride
39

47
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

Tên hình
Trang
Hình 1.1
Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin
4
Hình 1.2
Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
16
Hình 3.1
Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Bilberry với hệ pha
động 1
29
Hình 3.2
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động
2
29
Hình 3.3
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động
3
30
Hình 3.4
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin với hệ pha
động 4
30

Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không
chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin trên
HPTLC
36
Hình 3.14
Đường chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride
39
Hình 3.15
Đường chuẩn dung dịch bilberry trên HPTLC
40
Hình 3.16
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL
41
Hình 3.17
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL
42

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cuộc sống ngày càng phát triển hiện đại, các bệnh về tim
mạch, ung thư hiện đang rất phổ biến và có chiều hướng gia tăng nhanh. Đời
sống ngày càng phát triển, người dân cũng quan tâm đến sức khỏe của bản
thân nhiều hơn. Ở nước ta trong năm năm trở lại đây thực phẩm chức năng
được đưa vào và sử dụng rất rộng rãi, tràn lan vì chúng được biết đến là
những chế phẩm có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài để phòng ngừa nguy
cơ gây bệnh, bổ dưỡng mà rất an toàn, ít hoặc hầu như không có tác dụng phụ
đối với hầu hết các lứa tuổi. Chính vì thế việc mọi người lựa chọn thực phẩm
3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái niệm về thực phẩm chức năng:
Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật sử dụng đầu
tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những
thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ
cho người sử dụng. Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế (International
Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi
cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và
làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang
lại". Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần

OH O
+
3
R
2
OH
OH A
3
5
7
B

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của aglycon của anthocyanin
Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào
vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH
3
[8], [27].
Bảng 1. Cấu trúc cơ bản của Anthocyanin
Cấu trúc cơ bản
Anthocyanidin
R
3
′
R

−OH
−OH
−H
−OH
Pelargonidin
−H
−OH
−H
−OH
−OH
−H
−OH
Malvidin
−OCH
3

−OH
−OCH
3

−OH
−OH
−H
−OH
Peonidin
−OCH
3

−OH
−H

trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán nhờ màu sắc sặc sỡ trên cành hoa
và quả. Mặt khác,anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV nhằm bảo
vệ bộ gen của thực vật trước các tia tử ngoại. Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ
được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng
mạnh, UV, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phosphor, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn
thương, côn trùng, ô nhiễm… [12], [31].
Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học
Harvard (Mỹ), chất anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các
tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông
trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu
não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề
kháng. Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác
dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu,
6

hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng
nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất
này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Các nhà nghiên
cứu cũng phát hiện trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các
phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng. Các
nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa
lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa
bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng
dụng trong y học. Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất
thực phẩm, dược phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [21], [26].
Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin
được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy
hóa cho thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên
liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực
phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy

chất có hoạt tính sinh học, góp phần giúp trẻ lâu và phòng tránh bệnh tật. Bên
cạnh đó, anthocyanin có các đặc tính quý báu của chất màu tự nhiên mà các
chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được
[27], [31].
Cấu trúc của anthocyanin là những gì cho phép nó thay đổi màu sắc
khác nhau trong giá trị pH. Việc bổ sung các nhóm -OH vào trong cấu trúc
phân tử sẽ loại bỏ các điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấp thụ của
các proton bước sóng lớn hơn do đó do đó xuất hiện màu xanh lá cây xuất
hiện màu xanh lá cây [21], [22]. 8

1.2.4. Một số phương pháp phân tích Anthocyanin:
Stt
Kỹ
thuật
phân
tích
Mẫu
phân
tích
Điều kiện phân tích
Điều kiện xử lý
mẫu
Tài
liệu
tham
khảo
1

-Pha động: acetonitril - 10%
(v/v) acetic acid and 1%
(v/v) phosphoric acid trong
nước.
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Thể tích tiêm mẫu: 25µL
Lọc qua màng
lọc trước khi
tiêm sắc ký
[33]
3
HPLC
Mẫu
nước
hoa quả
-Cột Synergi Hydro-RP 80
Å (150.0 × 2.0 mm, 4 µm)
-Pha động: acetonitril–acetic
acid:trifluoroacetic
acid:acetonitril:nước(10:0,2:
5:84,8)
-Tốc độ dòng: 1 mL/phút
-Nhiệt độ cột: 25
o
C
-Detector MS: 520 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 20µL

-Detector :Absorbance, vis,
520 nm
-Thể tích tiêm mẫu: 2 µL
5
HPTLC
Powdere
d berry
extract
-Thiết bị: TLC sampler4
(ATS4, camag, muttenz,
switxerland)
-Bản mỏng: Silica gel 60
F254 (10mm × 20mm)
-Pha động: Ethylacetate:2-
butanone:nước:acid formic
(7:3:0,8:1,2)
-Quét sắc đồ ở 520 nm, tốc
độ 20 mm/giây
-Hiện vết: Phun thuốc thử
Dragendoft
Chiết với
methanol :
0,1%HCL, pha
loãng bằng ethyl
acetate
[16]
6
HPLC
Bilberry
extract

-Cột: YMC-pack ODS-AM
C18 (250×4,6 mm, 5 µm)
-Pha động: ACN:nước:acid
formic (87:3:10, v/v/v)-
acetonitril:nước:acid
formic (40:50:10, v/v/v)
-Tốc độ dòng: 0,8mL/phút
-Nhiệt độ cột: 40
0
C
-Thể tích tiêm: 25 µL
-Detector: Sử dụng kỹ
thuật ESI để ion hóa chất
phân tích và phân tích khối
phổ 2 lần MS/MS.
Mẫu được chiết
bằng
methanol/formic
acid(97:3)trước
khi tiêm sắc ký
[24]
10

1.3. Tổng quan về HPTLC
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng:
Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng
dụng từ lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít được sử dụng. Phổ biến nhất
hiện nay là sắc kí lớp mỏng. Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng đã được
sử dụng rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương
pháp này.

d
R
:

Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích.
d
M
: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo
trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
R
f
: Có giá tr ị dao động từ 0-1 [1].
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10–30µm được rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều
khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện
chất phân tích. Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [7], [9].
Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để
tăng cường rửa giải thường dùng 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ
số phân bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào
kinh nghiệm [1].
b .Kỹ thuật TLC:
 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:
Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng
đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị R
f
, lượng mẫu đưa lên bản
mỏng khoảng 0,1 - 50µg được pha trong dung môi thích hợp. Thể tích dung
dịch chấm 1 – 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc
ký điều chế.

phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá
trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt
13

chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành tại các
phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống
phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng.
Thiết bị của HPTLC:
- Thiết bị chấm mẫu bán tự động.
- Thiết bị phát triển tự động.
- Buồng chụp ảnh TLC được điều khiển thông qua phần mềm
winCAT và phần mềm Video Scan trên máy tính: quét bản mỏng với
hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải
cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy
tính [2], [19].
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa
vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates). Bản này
được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích
thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ
phân tích được tăng lên bởi vì:
 Vết sắc ký nhỏ hơn.
 Thời gian sắc ký ngắn hơn.
 Lượng dung môi dùng ít hơn.
Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu
năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường. Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả
HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10% [9], [13],
[29]
Ưu điểm của HPTLC:
+ Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng
+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều

R’
= t
R
- t
M
Hệ số phân bố K:
K =
M
S
C
C

Trong đó:
C
S
, C
M
: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
15

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong
hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng
hơn.
Hệ số dung lƣợng k’:
k’ =
M
S
MM
SS
V

R
M
B
R
A
B
A
B
tt
tt
k
k
K
K
'
'

Trong đó:
K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A
,k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
(t
R

1/2
: chiều rộng pic ứng với một nửa
chiều cao của pic.
Độ phân giải của cột:
Độ phân giải (R
S
) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong
hỗn hợp trên cột sắc ký:
R
S
=
BA
A
R
B
R
BA
A
R
B
R
WW
tt
WW
tt
,
2/1
,
2/1
.18,1

dung môi
Bơm
Bộ phận tiêm mẫu
Cột sắc ký
Detector
Hệ thống thu
nhận và xửa lý
số liệu (máy
ghi, máy tính)
Buồng cột
17

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến
dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền. Có thể loại khí hòa tan
bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ….
- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp
suất cao
 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: mỗi bình chứa dung môi có một
van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó
chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu.
 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng,
việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao.
- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm
đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo.
b. Bộ phận tiêm mẫu:
- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu
cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu. Vòng
chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL. Có vòng
chứa mẫu lớn hơn.