BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CORTICOSTEROID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CORTICOSTEROID
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình Sơn


DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Giới thiệu một số steroid trong nghiên cứu 2
1.2. Vai trò của nhóm corticosteroid 4
1.3. Tình hình sử dụng corticosteroid 5
1.4. Các phương pháp xác định corticosteroid 6
1.4.1. Phương pháp ELISA 6
1.4.2. Phương pháp điện di mao quản 6
1.4.3. Phương pháp sắc ký khí 6
1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng 7
1.5. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9
1.5.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 9
1.5.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC 11
1.5.3. Phương pháp chiết pha rắn 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 14
2.1.1. Thiết bị 14
2.1.2. Dụng cụ 14
2.1.3. Hóa chất 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 15
2.3.2. Phương pháp phân tích 15
2.4. Thẩm định phương pháp phân tích 16
2.4.1. Tính đặc hiệu và chọn lọc 16
2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 17
2.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 18
2.4.4. Độ lặp lại (độ chính xác) 19
2.4.5. Độ đúng 20

AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà hóa học
phân tích
HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
MS Mass spectrometry Khối phổ
ppb Parts per billion Phần tỷ
ppm Parts per million Phần triệu
RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn
UV Ultra violet Tử ngoại
Vis Visible Khả kiến
v/v Tỷ lệ theo thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Giới thiệu một số corticosteroid 2
Bảng 2.1. Các chất chuẩn corticosteroid 14
Bảng 2.2. Yêu cầu độ lặp lại tại các nồng độ khác nhau theo AOAC 20
Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 21
Bảng 2.4. Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 21
Bảng 3.1. Bảng khảo sát thành phần pha động 24

Hình 3.4. Sắc đồ phân tích với pha động H
2
O – MeOH 25

Hình 3.5. Sắc đồ phân tích với pha động H
2
O – ACN 25
Hình 3.6. Sắc đồ phân tích với pha động KH
2
PO
4
– ACN 25
Hình 3.7. Sắc đồ phân tích theo chương trình 1 26
Hình 3.8. Sắc đồ phân tích theo chương trình 2 27
Hình 3.9. Sắc đồ phân tích theo chương trình 3 27
Hình 3.10. Sắc đồ phân tích theo chương trình 4 28
Hình 3.11. Sắc đồ phân tích ở điều kiện tối ưu 29
Hình 3.12. Sắc đồ phân tích dung môi và dung dịch chuẩn 6 corticosteroid 32
Hình 3.13. Sắc đồ tại giới hạn phát hiện của 6 chất phân tích 35
Hình 3.14. Quy trình phân tích mẫu thực 41
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ
trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho
cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật. Một số
nhà sản xuất và kinh doanh đã lợi dụng lòng tin của người tiêu dùng nên đã thổi
phồng quá mức tác dụng của thực phẩm chức năng khiến không ít người coi thực
phẩm chức năng như là “thần dược” chữa bách bệnh.
Corticosteroid là nhóm chất có gốc steroid được tuyến thượng thận của cơ thể


Công thức
phân tử
Khối
lượng
phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
1
Cortison acetat
21-(acethyloxy)-
17-
hydroxypregna-
4-ene-3,11,20-
trione
C
23
H
30
O
6
402,49
Tinh thể màu
trắng, nhiệt độ
nóng chảy 220-
240
0
C.

phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
3
Prednison
17,21-
dihydroxypregn
a-1,4-diene-
3,11,20-trione
C
21
H
26
O
5
358,428
Dạng tinh thể
hoặc bột mịn
màu trắng,
không mùi và
có vị hơi đắng. 4
Prednisolon
(11β)-11,17,21-
trihydroxypregn
a-1,4-diene-

O
5
374,471
Dạng bột kết
tinh màu trắng,
điểm nóng
chảy từ 262 –
264
o
C.

4

TT
Tên

Công thức
phân tử
Khối
lượng
phân tử
(g/mol)
Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo
6
Betamethason
(8S,9R,10S,11S,
13S,14S,16S,17
R)-9-fluoro-

nước - điện giải bằng cách giúp tái hấp thu natri, bài tiết hydro và kali ở ống thận
xa, gây phù và cao huyết áp. Glucocorticoid cũng có một số tác dụng của
mineralocorticoid đồng thời tham gia vào một số chu trình chuyển hóa khác gồm:
tái tạo đường, phân bố lại mỡ, chuyển hóa protein và cân bằng calci.
5

Kháng viêm và ức chế miễn dịch: Glucocorticoid có tác dụng chống lại các
biểu hiện của quá trình viêm, do làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian
gây viêm như cytokin, ecosanoid, giảm giải phóng histamin.
Tác dụng chuyển hóa: Glucocorticoid làm tăng đường huyết lúc đói để cung
cấp glucose cho các mô phụ thuộc glucose như não và tim.
Tác dụng lên chất điện giải và cân bằng nước: Mineralocorticoid liều cao gây
giữ natri và nước, đồng thời gây đào thải kali, điều đó có thể dẫn đến phù và nhược
cơ. Các dẫn xuất tổng hợp ít gây tác dụng này. Ngăn hấp thu calci ở ruột và tăng
đào thải qua thận nên giảm dự trữ calci trong cơ thể. Sự đào thải Ca
2+
qua thận làm
tăng calci niệu. Có thể trị calci niệu do mineralocorticoid bằng lợi tiểu.
1.3. Tình hình sử dụng Corticosteroid

Corticosteroid là nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới trong
nhiều năm qua. Corticosteroid thường được coi là con dao hai lưỡi mà cả hai lưỡi
đều hết sức sắc bén.
Năm 1949, Hench, Richstein và Kendall đã dùng cortison để điều trị cho một
phụ nữ 29 tuổi gần như tàn phế vì chứng thấp khớp. Thành công này đã mở ra cho
những người bệnh thấp khớp một niềm hy vọng lớn, vì cho đến thời điểm đó việc
giúp cho người bệnh giảm bớt đau đớn và đem họ trở về với công việc thường nhật
hầu như là điều bất khả kháng. Những đột phá trong điều trị viêm khớp đã đem lại
cho êkíp của Hench giải Nobel y học danh giá vào năm sau đó, năm 1950.
Corticosteroid trở thành một thần dược, các labo tìm cách sản xuất các dạng

cộng sự phát triển năm 1999 [9]. Mẫu được làm giàu bằng kỹ thuật chiết pha rắn sử
dụng cột SPE C
18
biến đổi trên nền chất trơ của polytetrafluoroethylane. Mẫu nước
tiểu được đưa nhanh qua cột đã được hoạt hóa trước với 250μl methanol và 1ml
nước cất. Sau đó, cột được rửa 2 lần, mỗi lần 1ml hỗn hợp aceton : nước tỷ lệ 1 : 9
(v/v). Cuối cùng, rửa giải với 80μl ACN và phân tích trên hệ thống điện di mao
quản. Sử dụng hệ đệm 75mmol/l SDS, 20% ACN (v/v) và 20mmol/l MES (pH 6,0).
Ống mao quản đường kính trong 50μm x 375μm x 37cm. Mẫu được bơm vào hệ
thống dưới áp suất 5psi trong 20s và nhiệt độ cột được duy trì ở 16 ± 0,1
0
C, detector
7

UV bước sóng 254 nm và thế 10kV. Phương pháp cho độ thu hồi 89 - 94%, giới hạn
phát hiện là 10μg/l.
1.4.3. Phương pháp sắc ký khí [14]
Theo tài liệu hướng dẫn của hãng Thermo Fisher Scientific [14], phương pháp
GC-MS/MS có thể phân tích được các steroid. Thông số thiết bị gồm: thể tích bơm
mẫu là 1μl, sử dụng cột Rtx-CLP 0,32mm x 20m x 0,5micron và tốc độ khí là
1ml/phút. Chương trình gradient nhiệt độ cài đặt 60
0
C trong 1 phút sau đó tăng lên
220
0
C tốc độ 40
0
C/phút, tăng tiếp lên 260
0
C tốc độ 10


Để định lượng hàm lượng prednison, prednisolon, dexamethasone và cortisol
trong dịch huyết thanh, tác giả Valerie A.Frerichs, Kathleen M. Tornatore [15] cũng
dùng phương pháp LC-MS. Các chất được chuẩn bị trong hỗn hợp dung môi gồm
50% methanol và 50% dung dịch đệm acetat 5mM, pH 3,5 ở nồng độ 1ppm. Mẫu
được thu thập, thêm chuẩn sau đó được bảo quản ở -70
0
C trong 3 tháng. Khi phân
tích, giã đông mẫu và tiến hành xử lý chiết tách các steroid. Giới hạn phát hiện của
phương pháp từ 0,2 - 0,58ppb và giới hạn định lượng của phương pháp từ 5,4 -
10,7ppb tương ứng với từng hợp chất.
Adam Tolgyesi và cộng sự [7] năm 2011 đã phân tích các corticosteroid trong
mỡ lợn sử dụng sắc ký khối phổ. Các tác giả tiến hành nghiên cứu đối với 5 chất
thuộc nhóm corticosteroid bao gồm methyl prednisolon, methyl prednison,
prednisolon, dexamethasone, flumethasone. Phương pháp có độ thu hồi từ 81-
100%, giới hạn phát hiện trong khoảng 0,1 - 0,3μg/kg, thời gian phân tích chỉ
7,5phút. Độ lệch chuẩn tương đối trong phòng thí nghiệm và độ tái lặp giữa các
ngày phân tích cũng cho kết quả trong giới hạn cho phép.
1.4.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng với detector huỳnh quang [16]
Nhiều tác giả đã nghiên cứu sử dụng detector huỳnh quang để tăng độ nhạy và
độ chọn lọc. Bản thân các steroid không có khả năng phát huỳnh quang, vì vậy khi
sử dụng phương pháp này các steroid được tạo dẫn xuất có khả năng phát huỳnh
quang.
Wei Gao và cộng sự [16] xác định cortisol trong tóc bằng cách cho cortisol tạo
dẫn xuất với axit sulfuric trong methanol (70:30 theo thể tích) trong 2 phút ở nhiệt
độ 70
0
C. Dẫn xuất sau đó được cho qua cột SPE C
18
để làm sạch và làm giàu mẫu.

giới hạn phát hiện thu được của betamethason là 0,05mg/kg và 0,02mg/kg, với các
hợp chất khác là 0,01mg/kg và 0,02mg/kg.
1.5. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.5.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng [3], [4], [5]
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc
chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng). Mẫu phân tích
được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất
phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất
phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả
năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với
tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
1.5.1.1. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng
10

Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết
thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
+ Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức
phân cực: -NH
2
, -CN…)
+ Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân
cực, loại thông dụng nhất là –C
18
H
37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đa
dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực. Hơn nữa, trong rất nhiều

+ Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh
quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải dẫn xuất hoá chất
phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang hoặc chất phân tích phản
ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
+ Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các ion, các hợp
chất có tính dẫn điện…
Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được phát triển như: detector PDA,
MS, cho độ nhạy và độ chọn lọc tốt hơn.
1.5.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [3], [4]
Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của
các chất. Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch
phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp.

Hình 1.2. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký
Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn
hoặc so sánh.
12

1.5.3. Phương pháp chiết pha rắn [5]
Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu với mục đích để làm
giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha
rắn. Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi thích hợp.
Các chất ảnh hưởng được loại bỏ.
Cột SPE được nhồi bằng những hạt nhỏ, xốp có các nhóm chức khác nhau. Chất
lỏng qua cột dưới tác dụng của áp suất hoặc chân không.
Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 1.3. Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn
Bước 1: Hoạt hoá chất hấp phụ pha rắn
+ Làm ướt vật liệu nhồi, chuyển các nhóm chức của chất hấp phụ về dạng hoạt

14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao của Shimadzu, Máy lắc vortex VELP, Máy
li tâm lạnh Hermle, Cân phân tích (0,1mg và 0,01mg), Cân kĩ thuật (0,01g), Máy cất
quay chân không Eyela.
2.1.2. Dụng cụ
Ống ly tâm 50ml, Ống đong, Các loại pipet, Màng lọc mẫu 0,2µm, Bình định
mức, Ống nghiệm thủy tinh có nút xoáy, Bộ chiết pha rắn SPE
2.1.3. Hóa chất
+ Các corticosteroid chuẩn
Bảng 2.1. Các chất chuẩn corticosteroid
STT Tên chuẩn Xuất xứ Độ tinh khiết
1 Cortison acetat Viện kiểm nghiệm thuốc TW

99,7%
2 Hydrocortison acetat
Viện kiểm nghiệm thuốc TW
99,8%
3 Prednison
Viện kiểm nghiệm thuốc TW

4
20mM trong nước, kênh B
là ACN.
2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Đối tượng nghiên cứu: Thực phẩm chức năng
+ Nội dung nghiên cứu của đề tài này là:
- Xây dựng quy trình phân tích một số chất thuộc nhóm corticosteroid bằng
kỹ thuật sắc ký lỏng với detector UV
- Lấy mẫu và áp dụng phương pháp để đánh giá một số mẫu thực tế.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
+ Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm
cân, làm đẹp, tăng cường sinh lực, hỗ trợ trong điều trị và phòng viêm xương khớp.
+ Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
+ Địa điểm: Thành phố Hà nội
+ Đơn vị mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu
+ Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường.
2.3.2. Phương pháp phân tích
+ Nguyên tắc: Các corticosteroid được tách ra khỏi nền mẫu bằng methanol, cô
đuổi dung môi methanol. Hòa tan phần cặn trong nước, làm sạch qua cột chiết pha
rắn C
18
, dịch sau khi qua cột SPE được tách và định lượng bằng kỹ thuật sắc ký
lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV.
+ Quy trình phân tích dự kiến như sau:
16 Hình 2.1. Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến
+ Tóm tắt quy trình: