BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ TRÀ

XÁC ĐỊNH COLLAGEN
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất
2. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia


Sinh viên
Vũ Thị Trà
MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng. 2
1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng 2
1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng 2
1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng 3
1.2. Collagen. 3
1.2.1. Định nghĩa 3
1.2.2. Thành phần collagen 4
1.2.3. Cấu trúc collagen 4
1.2.4. Ứng dụng của collagen 5
1.2.5. Các phương pháp xác định collagen 7
1.2.6. Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin 9
1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11
1.3.1. Định nghĩa 11
1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 12
1.3.3. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng 13
1.3.4. Pha động trong sắc ký lỏng 14
1.3.5. Detector trong sắc ký lỏng 14
1.4. Thẩm định phương pháp phân tích 15
1.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc. 15
1.4.2. Khoảng tuyến tính. 16
1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 16
1.4.4. Giới hạn định lượng (LOQ) 17

3.2.5. Độ đúng 38
3.2.6. Độ lặp lại 40
3.3. Kết quả phân tích mẫu thực 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 435
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ACN
Acetonitrile
Acetonitril
ACQ
6-aminoquinolyl-N-
hydroxy succinimidyl
6-aminoquinolyl-N-
hydroxy succinimidyl
DABS-Cl
Dimethylaminoazobenzene
Sulfonyl Chloride
Dimethylaminoazobenzen
Sulfonyl Chlorid
FMOC
Fluorenyl
Methyloxycarbonyl
Chloride

HPLC

Limit of quantitation
Giới hạn định lượng
RSD
Relative standard devition
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
TEA
Trietylamine
Trietylamin
TPCN
Functional food
Thực phẩm chức năng
UV-VIS
Ultraviolet - Visible
Tử ngoại- khả kiến DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Một số phương pháp xác định collagen 8
Bảng 3. 1. Khảo sát nồng độ acid 23
Bảng 3. 2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân 24
Bảng 3. 3. Khảo sát thời gian thủy phân 25
Bảng 3. 4. Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất 27
Bảng 3. 5. Khảo sát thời gian dẫn xuất 28
Bảng 3. 6. Các điều kiện tối ưu thủy phân và tạo dẫn xuất mẫu 29
Bảng 3. 7. Các chế độ gradient 31
Bảng 3. 8. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin. 36
Bảng 3. 9. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống 37

Hình 3. 7. Sắc ký đồ của dung dịch hydroxyprolin thu được với chương trình
gradient 1(A), 2(B), 3(C) và 4(D). 33
Hình 3. 8. Quy trình phân tích collagen trong chế phẩm thực phẩm chức năng bằng
phương pháp HPLC 34
Hình 3. 9. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 35
Hình 3. 10. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin 36

1

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, khi mức sống của con người không ngừng được cải thiện, nhu cầu
nâng cao chất lượng cuộc sống ngày càng được quan tâm. Chăm sóc sức khỏe và
làm đẹp là những nhu cầu như vậy, đặc biệt là đối với phụ nữ. Người ta bắt đầu tìm
đến những dịch vụ, sản phẩm giúp chăm sóc sức khỏe và làm đẹp nhanh hơn, tốt
hơn, tiện dụng hơn. Chính vì thế, thực phẩm chức năng (TPCN) là một trong những
lựa chọn đầu tiên của nhiều người.
Gần đây, một trong những thành phần hay được sử dụng trong nhiều nhóm
sản phẩm khác nhau là collagen. Trong đó, nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng
chứa collagen hiện đang lưu hành trên thị trường như Collagen Tây Thi, Nippi, My
Vita Collagen,…. Collagen là một loại protein chiếm 70% cấu trúc da, phân bố chủ
yếu ở lớp hạ bì của da, có vai trò quan trọng với sức khỏe, đặc biệt là với làn da,
mạch máu, xương khớp, mắt [11] … Chính vì tác dụng rất lớn của collagen mà
nhiều nhà sản xuất đã lạm dụng nó trong các sản phẩm của mình hoặc làm giả, làm
nhái các sản phẩm có chứa collagen. Do vậy, cần phải có phương pháp phân tích
phù hợp để xác định hàm lượng collagen trong các sản phẩm trên thị trường.
Cho tới nay đã có khá nhiều phương pháp xác định collagen trong các đối
tượng khác nhau như sắc ký lỏng hiệu năng cao các loại, tạo màu đo quang,…Tuy
nhiên, mỗi phương pháp có những nhược điểm nhất định như quy trình xử lý phức
tạp, dẫn xuất kéo dài, tốn kém, khó áp dụng vào điều kiện tại Việt Nam…Do đó

Như vậy, có thể thấy có rất nhiều định nghĩa về thực phẩm chức năng nhưng nhìn
chung đều có các đặc điểm chung: là thực phẩm hoặc sản phẩm dùng để hỗ trợ,
phục hồi chức năng của các bộ phận trong cơ thể, giúp cơ thể tăng cường đề kháng,
giảm bớt nguy cơ bệnh tật.
1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng
Có nhiều cách để phân loại thực phẩm chức năng, cách phổ biến thường được sử
dụng là phân loại theo tác dụng của chúng. Theo cách phân loại này thì thực phẩm
chức năng bao gồm các nhóm sau:
• Nhóm bổ sung vitamin và khoáng chất
3

• Nhóm thực phẩm chức năng “không béo”, “không đường”, “giảm năng lượng”
• Nhóm các loại nước giải khát, tăng lực
• Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa
• Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột
• Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt, bao gồm thức ăn cho phụ nữ có thai, người
cao tuổi, vận động viên, phi hành gia, người đái đường, cao huyết áp,…
1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng
Theo Thông tư quy định về quản lý thực phẩm chức năng của Bộ Y tế ban hành
ngày 24/11/2014 [1], TPCN cần đạt các yêu cầu sau:
+ Công bố hợp quy và phù hợp quy định an toàn thực phẩm
+ Yêu cầu về báo cáo thử nghiệm hiệu quả về công dụng
+ Yêu cầu kiểm nghiệm
+ Yêu cầu đối với ghi nhãn thực phẩm chức năng
+ Quảng cáo thực phẩm chức năng
TPCN cần đạt các yêu cầu về điều kiện sản xuất, kinh doanh và hướng dẫn sử dụng
TPCN.
1.2. Collagen
1.2.1. Định nghĩa
Collagen là một loại protein được tìm thấy ở động vật, đặc biệt là trong các mô thịt

collagen này. Thông thường các chuỗi theo mẫu Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây
X và Y là các acid amin còn lại [10]
1.2.4. Ứng dụng của collagen
Collagen là một loại vật liệu đa năng, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
1.2.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp
Ngày nay, collagen được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:
- Trong công nghiệp thực phẩm: collagen được sử dụng như chất đông, chất
gây lắng trong thực phẩm, dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo,
nguyên liệu sản xuất một số thực phẩm dinh dưỡng,…Collagen hydrolysate
được sử dụng nhằm ngăn chặn sự mất nước trong các sản phẩm phomat, tạo
độ dẻo, dai, mềm trong kẹo dẻo; làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp
trong kẹo mứt,…
- Collagen được dùng thay thế cao su, keo dán, xi măng, là chất tạo kết dính
trong diêm quẹt. Chúng được dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân.
6

1.2.4.2. Ứng dụng trong y học và dược phẩm
Collagen có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau như da trâu, bò, lợn, gân, ruột
động vật nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi như một loại nguyên liệu y khoa [13],
[17]
- Màng collagen được sử dụng trong nha chu và các liệu pháp cấy ghép như
những rào cản để ngăn chặn sự di chuyển của biểu mô tế bào.
- Bác sỹ da liễu và phẫu thuật thẩm mỹ sử dụng collagen để tăng thêm mô
mềm, sửa chữa vết sẹo, làm mịn da, giảm nếp nhăn.
- Với bệnh nhân bỏng, phong, collagen được sử dụng để bảo vệ bề mặt da.
Collagen đang được dùng rộng rãi để thay thế da nhân tạo, được sử dụng
trong việc chữa trị bỏng nặng. Collagen có thể được sử dụng trực tiếp hoặc
sử dụng kết hợp với silicon, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các yếu tố
tăng trưởng và các chất khác.
- Collagen có thể ứng dụng trong tái tạo mạch máu, tái sinh dây thần kinh

Tuy nhiên, vì lượng collagen trong mẫu TPCN thường tương đối lớn, sử dụng LC-
MS/MS phải pha loãng nhiều dễ gây sai số, điều kiện trang thiết bị không sẵn có ở
đa số phòng thí nghiệm, nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp
tạo dẫn xuất để phân tích trên hệ thống HPLC thông dụng với detector UV-VIS
hoặc huỳnh quang.

8

Bảng 1. 1. Một số phương pháp xác định collagen
STT
Phương
pháp
Đối tượng
phân tích
Quy trình
Điều kiện phân tích
1
Tạo màu đo
quang [8]
[9]
Mô, nước
tiểu
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
Ehrlich, đo
quang
+ Hóa chất: đệm (natri

+ Detector huỳnh quang, Ex:
260 nm, Em: 310nm
+ Cột C18 4,6×150 mm, 5 µm
3
HPLC sử
dụng kết
hợp dẫn
xuất FMOC
và OPA
[12], [21]
Mô cơ
Làm nhỏ,
thủy phân
mẫu, tạo
dẫn xuất với
thuốc thử
FMOC và
OPA, chạy
sắc ký.
+ Pha động: A (NaH
2
PO
4
40mMpH 7,8), B (ACN:MeOH:H
2
O
45:45:10 v/v/v)

0,01M:
ACN 65:35
5
Xác định
collagen sử
dụng
HPLC-
MS/MS
[38]
Collagen
thương
mại, da,
cơ chuột
Xử lý mẫu,
tạo dẫn
xuất, chạy
HPLC-
MS/MS
+ Tốc độ dòng pha động: 0,25
ml/phút, thể tích tiêm: 40µl
+ Nhiệt độ cột: 25
0
C
+ Detector hấp thụ UV: 214 nm
+ Pha động: A (nước/acid
formic 100:0,03 v/v), B
(ACN/acid fomic 100:0,025 v/v)
+ Cột C12 250×2mm, 4µm
+ Chế độ ion hóa: API-ESI sử
dụng N

trọng trong sự ổn định collagen.
Năm 1975, Darwin và cộng sự đã phát hiện nhóm OH của hydroxyprolin có vai trò
chủ yếu trong việc ổn định vòng xoắn ba của collagen. Chuỗi polypeptid collagen
nếu thiếu hydroxyprolin thì có thể vẫn tạo thành xoắn ba ở nhiệt độ thấp nhưng
không vững bền ở thân nhiệt. Nghiên cứu trên peptid tổng hợp người ta đã chứng
minh được rằng nếu mạch alpha chỉ chứa prolin, hydroxyprolin và glycin thì sẽ tạo
xoắn ba rất vững bền [7].
1.2.6.3. Tỷ lệ hydroxyprolin/collagen
Hydroxyprolin là acid amin đặc trưng của collagen. Hydroxyprolin không có trong
bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có
thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyprolin.
Lượng hydroxyprolin có trong các chế phẩm collagen từ các nguồn động vật có vú
đã được tìm thấy vào khoảng 13,4 0,24%. Hydroxyprolin có thể chuyển đổi
tương đương sang collagen thông qua hệ số 7,46. Phần trăm collagen của mẫu có
thể được tính như sau [24], [23]:

%collagen 
microgam hydroxyprolin trong 1 ml dịch thủy phân
microgam mô cơ trong 1 ml dịch thủy phân
   
11

1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.3.1. Định nghĩa
Sắc ký (chromatography) là quá trình tách trong đó hỗn hợp mẫu được phân bố giữa
hai pha, một pha đứng yên (pha tĩnh) trong khi pha còn lại (pha động) chuyển động
qua pha tĩnh.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) là
kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng
và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh.

bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động).
Thời gian lưu hiệu chỉnh: t
R’
= t
R
- t
M
Hệ số phân bố K:
 






Trong đó, C
S
, C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động
K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Các chất trong hỗn
hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn.
Hệ số dung lượng k’:
 


 










 



 


K
B
, K
A
lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước).
k’
A
,

k’
B
tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B.
t
RA
, t
RB
tương ứng là thời gian lưu của chất A, B.

học và điện hóa: detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số
khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn. Tùy thuộc bản
chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.
Detector UV-VIS (Ultraviolet/visible detector) được dùng phổ biến nhất trong sắc
ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS (trong khoảng 190-800 nm), áp dụng
cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng
khả kiến (VIS).
Detector huỳnh quang (Fluorescence detector FLD) sử dụng để phát hiện các chất
có khả năng phát huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng phát huỳnh
quang, cần dẫn xuất chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang
15

hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử tạo thành sản phẩm có khả năng phát
huỳnh quang.
Đối với detector hấp thu UV/VIS, sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đổi độ hấp
thu theo thời gian. Các loại detector hấp thu có giới hạn phát hiện từ 0,1 đến 1 ng
chất phân tích. Detector huỳnh quang chỉ chọn lọc đối với một số chất phân tích có
khả năng phát huỳnh quang . Sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đồi của cường độ
huỳnh quang theo thời gian, giới hạn phát hiện của detector huỳnh quang từ 1 đến
10 pg.
Detector huỳnh quang chọn lọc hơn và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector
hấp thụ UV. Detector huỳnh quang có độ nhạy 10
-9
mg/mL, khoảng tuyến tính là
10
4
. Nó đáp ứng với các chất phát huỳnh quang như: hợp chất thơm đa vòng, dẫn
chất quinolin steroid và alcaloid…[6]
1.4. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp là việc tiến hành kiểm tra và cung cấp các bằng chứng

Đối với phương pháp định lượng, có thể xác định LOD dựa trên độ lệch chuẩn
hoặc dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) hoặc dựa trên đường chuẩn. Ở đây
chúng tôi sử dụng phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn, làm trên mẫu thử. Làm 10
lần song song.
Tính LOD: Tính giá trị trung bình x
tb
và độ lệch chuẩn SD
LOD = 3×SD
 




 



  
Đánh giá LOD đã tính được: tính R= x
tb
/LOD.
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin
cậy
17

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn
vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R



 



  
Trong đó:
SD là độ lệch chuẩn, n: số lần thí nghiệm
x
i
:

giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ i, x
tb
: giá trị trung bình của các lần thử
nghiệm
RSD%: độ lệch chuẩn tương đối, CV%: hệ số biến thiên