BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUYÊN
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ DUYÊN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

Nơi thực hiện:
Phòng phân tích , kiểm nghiệm và tương
đương sinh học
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1. Vài nét về Glucocorticoid 3
1.1.1. Tác dung và tác dụng không mong muốn của Glucocorticoid 3
Tác dụng 3
Tác dụng không mong muốn 3
1.1.2. Đại cương về dexamethason và dexamethason acetat 4
1.1.2.1. Dexamethason 4
1.1.2.2. Dexamethason acetat 6
1.2. Một số nghiên cứu xác định dexamethason và dexamethason
acetat 7
1.3. Thực trạng thuốc đông dược và thực phẩm chức năng bị trộn
tân dược 9
1.4. Phương pháp xử lý mẫu 10
1.4.1. Phương pháp chiết trực tiếp 11
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng 11
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn 11
1.5. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng 12
1.5.1. Nguyên tắc 12
1.5.2. Pha tĩnh 13

1.5.3. Pha động 13
1.5.4. Dụng cụ 14
1.5.5. Ứng dụng của SKLM 15
1.5.6. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng 17
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NÔI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 18
2.1.1. Máy móc, thiết bị 18
2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn 18
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

R
f
SKĐ
SKLM
S/N
SPE
STT
TLC
TLTK
TPCN
t
R
UV
VIS
: Acetonitril
: Detector diod array
: Dung môi
: Dung môi khai triển
: Glucocorticoid
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
: Sắc ký lỏng khối phổ
: Methanol
: Hệ số lưu giữ
: Sắc ký đồ
: Sắc ký lớp mỏng
: Signal/noise
: Solid phase extration

Hình 3.9. SKĐ giới hạn phát hiện của Dexamethason và Dexamethason
acetat 31
Hình 3.10. SKĐ analog xác định LOD 32
Hình 3.11. SKĐ đánh giá độ lặp lại của phương pháp chiết 34
Hình 3.12. SKĐ chụp ảnh và analog của dịch chiết mẫu tự tạo R 34
Hình 3.13. SKĐ chụp ảnh và analog của dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,5
mg/ml 35
Hình 3.14. SKĐ của mẫu thử 37
Hình 3.15: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dexamethason và dexamethason
acetat 38
Hình 3.16. Phổ hấp thụ tại pic chất chuẩn 39
Hình 3.17. SKĐ mẫu thuốc trị Viêm mũi 39
Hình 3.18. Phổ hấp thụ của mẫu thuốc trị viêm mũi tương ứng với t
R
=
8,539 39
Hình 3.19.SKĐ mẫu bột thuốc của cơ sở Đặng Đình Toàn 40
Hình 3.20. Phổ hấp thụ tương ứng với t
R
= 8,535 của mẫu bột thuốc của cơ
sở Đặng Đình Toàn 40
Hình 3.21. SKĐ mẫu phong tê nhức khớp thủy 40
Hình 3.22. SKĐ mẫu phong tê cốt thống thủy 41
Hình 3.23. Phổ hấp thụ tương ứng với t
R
= 8,546 của mẫu phong tê cốt
thống thủy 41 1

đông dược.
Nghiên cứu định tính, định lượng các glucocorticoid trộn trái phép vào thuốc
đông dược đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu, đã có một số
công bố về xác định dexamethason, dexamethason acetat bằng các phương
pháp khác nhau như: HPLC-MS, HPLC-DAD… Tuy nhiên các phương pháp
này yêu cầu máy móc khá đắt tiền. Để đóng góp một phương pháp phân tích
nhanh, đơn giản và kinh tế hơn trong xác định chất cấm dexamethason,
dexamethason acetat trong thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài:
“Nghiên cứu phát hiện Dexamethason trong một số chế phẩm đông dược
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng”
Với mục tiêu cụ thể sau đây:
1. Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, dexamethason
acetat trong chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng bằng sắc ký lớp
mỏng
2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để phát hiện dexamethason,
dexamethason acetat trong một số chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng
(dạng thuốc nước và thuốc rắn) có nghi ngờ trên thị trường. 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Vài nét về Glucocorticoid
1.1.1. Tác dung và tác dụng không mong muốn của Glucocorticoid
Tác dụng:
GC tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất là
hydrocortison (cortisol) và cortison. GC tổng hợp gồm nhiều chất khác
nhau.Ở nồng độ sinh lý, các chất này cho cân bằng nội môi, tăng sức chống
đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác nhau của cơ thể. GC có

FO
5
P.t.l: 392,5
Tên khoa học: 9-fluoro-11β,17,21-trihydroxy-16α-methylpregna-1,4-dien
3,20-dion.
 Tính chất vật lý: [4], [7], [20], [21].
Bột kết tinh trắng hoặc tinh thể không màu, không mùi. Chảy ở 253 – 255
0
C
(kèm phân hủy). Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan
trong methylen clorid, tan trong aceton.
 Định tính: [4], [20].
- Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với phenylhydrazin
trong môi trường acid cho dẫn chất phenihydrazon có màu vàng (hấp thụ cực
đại ở 419nm).
- Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
dexamethason chuẩn.
- Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng Silicagel GF
254
hệ
dung môi triển khai là butanol bão hòa nước – toluen – ether (5: 10: 85).
- Phản ứng màu: Oxy hóa với tác nhân H
2
SO4 đặc, có màu đỏ nhạt (thường
kèm huỳnh quang). Pha loãng với nước, màu biến mất.
 Định lượng: [4], [20]
- Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS): Hòa tan chế phẩm trong

5
ethanol; đo ở khoảng 238,5nm, mẫu trắng là ethanol. Lấy E (1% 1cm) của
C
24
H
31
FO
6
P.t.l: 434,5
Tên khoa học: 9-fluoro-11β,17-dihydroxy-16α-methyl-3,20-dioxopregna-1,4-
dien-21-yl acetat
 Tính chất vật lý: [4], [7], [20], [21].
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình. Dễ tan trong ethanol 96% và
aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không tan trong nước.
 Định tính:[4], [20].
- Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với phenylhydrazin
trong môi trường acid cho dẫn chất phenihydrazon có màu vàng (hấp thụ cực
đại ở 419 nm).
- Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
dexamethason acetat chuẩn (ĐC). Nếu các phổ thu được của chế phẩm và của
chất chuẩn ở dạng rắn khác nhau, đo thêm phổ ở dạng lỏng: dùng dung dịch
bão hòa (nồng độ khoảng 3%) của chế phẩm và của chất chuẩn trong
cloroform (TT) với tế bào đo dày 0,2 mm.
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: Silica gel GF
254
.
Dung môi khai triển: Nước - methanol - ether - methylen clorid (1,2 : 8 : 15 :
77).


Trực tiếp
Cloroform
Thuốc nước
Pha loãng,
lỏng lỏng
Methanol-nước (1:1)
Ethyl acetat
[20]
Bột
Trực tiếp
Ethanol
Thuốc nước
Pha loãng
Methanol-nước
[16]
Huyết tương
người
Chiết lỏng lỏng
Ethyl acetat
[17]
Thực phẩm
Chiết pha rắn
C18 catridge
[19]
Viên nén
Chiết trực tiếp
Methanol
Máu
Chiết lỏng lỏng
Aceton-Methanol (1:1)

(77:15:8:1,2)
Hệ 2: Dicloromethan-methanol-nước
(95:5:0,2)
Hệ 3: dicloromethan-methyl acetat-nước
(100:50:50) (lấy lớp dưới)
- V chấm = 2 µl
- Phát hiện: soi UV (254 nm), phun dung dị
ch
acid H
2
SO
4
20% trong ethanol rồi soi ở 366

nm, phun dung dịch xanh tetrazolium kiềm.
[11]
3
HPLC

- Pha động: ACN-nước (44-56)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Detector (240 nm)

4
TLC
- DMKT: Dicloromethan-ether-methanol-
nước (77:15:8:1,2)
- V chấm = 5 µl
- Phát hiện: soi UV (254 nm), phun dung dị
ch

8
HPLC
- Cột C18
- Detector UV (239 nm)
[13]

9
1.3. Thực trạng thuốc đông dược và thực phẩm chức năng bị trộn tân
dược
Hiện nay, tình hình thuốc đông dược, thực phẩm chức năng bị trộn trái
phép tân dược đang xảy ra rất phổ biến và được cơ quan quản lý phát hiện
nhiều ở các vùng miền, từ các thành phố lớn đến các vùng tỉnh thành khác
trong toàn quốc. Các chế phẩm bị trộn tân dược cũng rất đa dạng và phong
phú, thủ đoạn của người sản xuất làm giả ngày một khéo léo và tinh vi (trộn
Tân dược vào vỏ nang mềm, lượng trộn được tính theo liều dùng của
thuốc, ). Trong đó nhóm thuốc đông dược bị trộn glucocorticoid hay gặp
nhất (vì thuốc có tác dụng nhanh và mạnh) và cũng gây ra nhiều tác hại cho
người tiêu dùng [26], [27], [28].
Một số thuốc đã bị phát hiện như:
- Nang mềm Tăng phì hoàn (Ceng Fui Yen) Malaysia sản xuất,trộn
Dexamethason, Cyproheptadin [24].
- Thuốc Dân tộc cứu nhân vật, sản xuất tại Campuchia, trộn 4 loại Tân dược
Dexamethason, Diazepam, Paracetamol và Cyproheptadin [24].
- Khu phong tê thấp thủy, và Truy phong tê thấp thủy của cơ sở sản xuất
thuốc YHCT Hinh hòa, TP Hồ Chí Minh bị trộn betamethason [25].
-Thuốc Bổ tỳ tâm của Phước Lợi Đường-Đà Nẵng có trộn cyproheptadin và
dexamethason [23].
- Một số đông dược và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu trộn
hoạt chất tăng cường khả năng sinh lý: Viên nang Supai 99 Tongkat Ali
plusdo Malaysia sản xuất có chứa Noracetildenafil; Viên nang Mãnh Nam do

Các thuốc đông dược thường là những thuốc có thành phần phức tạp, do
đó để phân tích các thuốc tân dược lẫn trong các thuốc đông dược thì việc xử
lý mẫu, tách chiết các chất cần quan tâm ra khỏi mẫu để định tính và định

11
lượng là rất quan trọng.
1.4.1. Phương pháp chiết trực tiếp
Chiết trực tiếp với dung môi hữu cơ là phương pháp chiết phổ biến nhất
trong kiểm nghiệm thuốc nhằm hòa tan dược chất. Tùy vào độ tan của dược
chất và tính chất của dung môi mà người ta lựa chọn cách hòa tan như ngâm,
khuấy, lắc cơ học, lắc siêu âm Khi chiết trực tiếp, còn có thể thay đổi thời
gian chiết, nhiệt độ để tăng hiệu suất chiết.
Phương pháp chiết trực tiếp thường được áp dụng cho các dạng mẫu rắn:
thuốc bột, thuốc viên, dược liệu hoặc dạng bán rắn như thuốc kem, thuốc mỡ.
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng
Là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang
dung môi thứ hai không đồng tan với dung môi thứ nhất, cất thu hồi dung môi
thu được chất phân tích. Tùy vào bản chất chất phân tích và mục đích nghiên
cứu có thể chiết dạng phân tử hay chiết cặp ion, chiết nội phức.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: độ tan của chất phân tích
trong dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác trong dung dịch.
Ứng dụng: Chiết lỏng lỏng được áp dụng khá phổ biến trong kiểm
nghiệm các thuốc dạng dung dịch như: thuốc nước, siro, rượu thuốc hay các
mẫu dịch sinh học như máu, nước tiểu Ngoài ra đối với mẫu phân tích dạng
rắn, người ta thường chuyển vào pha nước rồi chiết lỏng lỏng tách các nhóm
chất, tinh chế dịch chiết.
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn
Là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các
chất có ảnh hưởng tới chất cần phân tích, làm giàu chất trước khi phân tích
chúng. Các tài liệu tiếng Anh gọi là SPE (Solid phase extraction). Kỹ thuật

R/ d
M

Trong đó:
d
R
: Khoảng cách từ điểm xuất phát từ tâm đến vết phân tích (cm),
d
M
: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm)
R
f
: Có giá trị dao động giữa 0 và 1. 13
1.5.2. Pha tĩnh
Pha tĩnh của SKLM là các hạt có kích thước 10 – 30 µm được rải đều và
kết dính thành một lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ thủy
tinh, nhôm hoặc nhựa. Người ta thường đưa thêm chất phát huỳnh quang
không tan vào pha tĩnh để phát hiện chất phân tích. Một số chất thường dùng
làm pha tĩnh cho SKLM được trình bày trong bảng sau:
Bảng 1.3 : Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM
Pha tĩnh
Cơ chế sắc ký
Ứng dụng phân tích
Silica

O
3
) [1],[8].
1.5.3. Pha động
Pha động thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký, có thể sử dụng một hoặc
hỗn hợp nhiều dung môi với tỷ lệ thích hợp. Trong SKLM việc chọn dung
môi có ý nghĩa rất quan trọng. Tùy thuộc vào tính chất phân cực và ái lực với
pha tĩnh, ta lựa chọn dung môi phù hợp làm pha động khai triển. Muốn tách
các chất không hoặc ít phân cực phải dùng chất hấp phụ hoạt năng cao và

14
dung môi khai triển yếu (ít phân cực) và ngược lại [1].
Tuy vậy lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm. Sau
đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động SKLM [1]:
- Dung môi cần có độ tinh khiết cao.
- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R
f
nằm trong khoảng 0,2
– 0,8 đạt độ phân giải cực trị.
- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân
cực như hỗn hợp n-BuOH : H
2
O. Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào
nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng.
- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của
pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số R
f
của
chúng. Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi
không phân cực như methylbenzen thì sẽ làm tăng đáng kể trị số R

(CAMAG).
- Densitometer: Thiết bị đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi
dưới đèn UV-VIS.
1.5.5. Ứng dụng của SKLM
SKLM là một kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực hóa học, dược
phẩm, hóa sinh, lâm sàng vào 3 mục đích sau:
• Định tính
Thường dựa vào trị số R
f
của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong
cùng điều kiện. Mỗi chất trong một hệ sắc ký có một giá trị R
f
đặc trưng. Giá
trị R
f
phụ thuộc nhiều yếu tố như chất hấp phụ (loại chất hấp phụ, hoạt tính,
bề dày chất hấp phụ…), pha động (thành phần, độ tinh khiết, tốc độ di chuyển
của pha động ), độ bão hòa dung môi trong bình chạy sắc ký, chiều dài khai
triển, nhiệt độ, lượng mẫu, cách xác định tâm, độ chính xác của phép đo độ
dài… Để việc định tính được chính xác, không được thay đổi điều kiện thực
nghiệm và nên tiến hành một loạt phép đo để xác định giá trị trung bình.

16
Đôi khi do sắc ký liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động,
người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối R
r
để đặc trưng cho chất phân tích [1]:
R
r
= d

Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi
làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp
(phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ…). Phương pháp này hiện nay ít dùng vì
có nhiều trở ngại, lại mất thời gian.
 Định lượng trực tiếp trên bản mỏng:
Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

17
- Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc
huỳnh quang.
- Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số:
Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có
độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng
máy tính.
1.5.6. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng
• Ưu điểm [1]
- Chi phí thiết bị đơn giản, không đòi hỏi nhiều thao tác quá khó như nhiều
phương pháp khác mà vẫn cho một độ chính xác có thể chấp nhận được.
- Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động
(nằm ở điểm xuất phát).
- Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần: Có thể thực hiện sắc
ký đồng thời 10 – 20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn.
- SKLM cung cấp thêm thông tin bán định lượng về các thành phần chính của
thuốc và các tiền chất làm thuốc, do đó nó cho phép đánh giá chất lượng
thuốc.
• Nhược điểm [1]
- Trong một số trường hợp độ lặp lại của trị số R
f
thấp do thành phần pha
động thay đổi trong quá trình triển khai sắc ký.