BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DỊU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ
PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLCKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DỊU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ
PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC
thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, theo sát và động viên em trong suốt thời gian
qua.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 20 tháng 4 năm 2014
Sinh viên

NGUYỄN THỊ DỊU

MỤC LỤC
Danh mục kí hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục hình vẽ và đồ thị
Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Long đởm 2
1.2. Kem Viemda AD 4
1.3. Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5
1.3.1 Khái niệm 5
1.3.2 Cấu tạo của hệ thống máy HPLC 6
1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng……………………………………………………………………… 8
1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong sắc ký phân bố 10
1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 14
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG- HÓA CHẤT- THIẾT BỊ-NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD: Viêm da cơ địa
DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV
HPLC: Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao
DĐTQ: Dược điển Trung Quốc
H
2
O: Nước
MeOH: Methanol
EtOH: Ethanol
A: diện tích pic
m : khối lượng cân
tt/tt: thể tích trên thể tích
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng Trang

1.1

Bảng định lượng gentiopicrin trong mẫu thử
34 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình Trang

1.1
Công thức cấu tạo của Gentiopicrin
2
1.2
Bao bì chế phẩm kem Viemda AD
5
1.3
Cấu tạo hạt silica đã silan hóa
11
1.4
Cấu trúc cột LC-DB
12
1.5
Cấu trúc cột có gốc isopropyl
13
3.1
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A/m vào thời gian chiết
24

Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic dermatitis - AD), là
một bệnh viêm da mạn tính, bệnh thường xuất hiện ở trẻ em và có thể kéo dài
đến tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh có thể gặp ở người lớn [10]. Chàm thể
tạng là bệnh liên quan đến yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường. Ngày
nay, sự phát triển của xã hội, ô nhiễm của môi trường đã làm cho bệnh chàm
thể tạng có xu hướng tăng [6]. Điều trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu,
chủ yếu sử dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm và giảm các phản
ứng dị ứng. Tuy nhiên, nhóm thuốc này gây rất nhiều tác dụng phụ như: lệ
thuộc thuốc, dị ứng thuốc, viêm nhiễm mắc kèm, Do vậycần phát triển
thuốc có khả năng điều trị chàm thể tạng nhưng ít hoặc không có tác dụng
phụ.
Một trong các biện pháp đang được nghiên cứu hiện nay là các chế
phẩm từ dược liệu. Trong đó, Long đởm đã được biết đến trong y học cổ
truyền có tác dụng điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, và các bệnh viên
nhiễm khác [2], [4]. Chế phẩm kem Viemda AD được điều chế từ cao đặc
long đởm có thành phần chính là gentiopicrin đang được nghiên cứu để có thể
dùng trong điều trị chàm thể tạng. Để đưa thuốc vào sản xuất và sử dụng cần
đảm bảo yêu cầu chất lượng theo quy định.
Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và tiêu
chuẩn hóa một chế phẩm sản xuất từ dược liệu nói riêng chúng tôi thực hiện
đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm
kem Viemda AD bằng HPLC”
Với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích gentiopicrin trong Kem
viemda AD bằng HPLC
2. Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin trong chế
phẩm
Hình 1.1: Công thức cấu tạo Gentiopicrin
3
Tên khoa học: (5R-trans)-5-Ethenyl-6-(-D-glucopyranosyloxy)-5,6-
dihydro-1H,3H-pyrano[3,4-c]pyran-1-one
Trọng lượng phân tử: 356.32
Tính chất:
Phân tử có màu trắng hoặc vàng nhạt thậm chí có kết tinh màu đỏ; dễ tan
trong nước, methanol hoặc ethanol; dễ biến sắc dưới ánh sáng mặt trời. Độ tan
trong nước: 43g/l (25
0
C), điểm chảy: 191
0
C, điểm sôi: 668
0
C.Kết tinh từ ethyl
acetat hoặc alcohol tuyệt đối. Điểm chảy 191°C. []
D
20 là 199° (ethanol). uv
max (c = 0,0285 g/l methanol): 270 nm (log  3.96) [17].
Công dụng của Long đởm đã được biết trong y học cổ truyền là thanh
nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thực, tiêu viêm, sưng mù [2], [4]. Trong y học
hiện đại, long đởm được biết đến là vị thuốc có tác dụng phòng sự lên men
(uống ít, nửa giờ trước bữa ăn), tác dụng kích thích sự bài tiết dịch tiêu hóa,
khỏe dạ dày [4], [1]. Các iridoid có tác dụng ức chế và thu gom các gốc tự do
như peroxyd, superoxyd, do đó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm oxy hóa
tế bào, đẩy nhanh quá trình nhu mô hóa tế bào, đồng thời giảm nồng độ men
gan. Ngoài ra, các alcaloid trong long đởm có tác dụng kháng khuẩn, chống
viêm do tác dụng hạ thấp men chuyển hóa amin, trên thực tế có thể dùng
trong dự phòng viêm màng não truyền nhiễm, nước sắc long đởm có tác dụng
ức chế trực khuẩn mủ xanh, tụ cầu vàng, trực khuẩn lị [4], [1], [12].


Kem Viemda AD đóng gói trong tuýp nhựa, 20 g, kín. Hình 1, trình
bày nhãn và chế phẩm đóng gói kem Viemda AD [8].

5 TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ HÀ NỘI
VIEMDA AD CREAM

Kem bôi ngoài da 20gam
(Sản phẩm nghiên cứu, không bán)
TCCS:
SĐK: SKS: HD:
Thành phần:
Cao đặc Long đở
m
10g
Tá dượ
c vđ
100g
Công dụng:
Chống viêm, dị ứng,
nhiễm khuẩn ngoài
da.
Cách dùng:
Bôi kem lên vùng tổn
thương ngày 3-4 lần
Chỉ định:
Viêm da cơ địa

- Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành
phần trong một hỗn hợp. Sự tách các chất được dựa trên sự phân chia
6
khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào
nhau: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh được cố định trên cột hay
trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển
qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác
pha tĩnh-pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các
thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân
tích định tính, định lượng.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatoghraphy - HPLC) là một nhóm các phương pháp hóa lý dựa
vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc
và không đồng tan với nhau. Pha động là một chất lỏng chảy qua cột
với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất rắn dưới
dạng hạt mịn hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hóa học.
1.3.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.2.1 Hệ thống cấp pha động [12]
Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai hay nhiều dung môi hòa tan
vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp. Trước khi chạy mẫu,
pha động cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động. Khí
hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền.
Có hai cách dùng để rửa giải pha động:
- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình
sắc ký.
- Gradient: Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4 loại
được đựng trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần dung
môi, lưu lượng dòng hoặc cả tỷ lệ các thành phần và lưu lượng
dòng thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định.
1.3.2.2 Bơm cao áp [12]

8
Cột bảo vệ được lắp trước cột sắc ký để loại các tạp chất có trong mẫu
phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột. Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký,
được nhồi hạt cùng loại.
1.3.2.5 Detector [12]
Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín
hiệu ghi trên sắc ký đồ. Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:
- Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích đối với detector hấp thụ UV
hoặc huỳnh quang.
- Tính chất chung của chất phân tích trong pha động như detector
chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện.
Detector trong sắc ký cần đáp ứng các yêu cầu sau:
- Đáp ứng nhanh và lặp lại
- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc
nồng độ thấp
- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
- Khoảng tuyến tính rộng
- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng.
1.3.2.6 Hệ thu nhận và xử lý số liệu [12]
Máy tính kết nối trực tiếp với hệ thống sắc ký, có phần mềm điều khiển
xử lý các số liệu về thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý
thuyết
1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng:
 Thời gian lưu t
R
[12]
Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ
nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, đến detector và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc
tiêm mẫu đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. Thời gian lưu là thông tin về mặt

C
s
là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh
C
M
là nồng độ mol của chất tan trong pha động
 Hệ số dung lượng k
’
[12]
Cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha và được
tính theo sức chứa của cột:
Lý thuyết: k
’
=K ×




Thực nghiệm: k
’
=






Trong đó:
V
S

′
=

()



()



Quy ước: Chất B là chất lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1
Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0
 Hệ số đối xứng pic AF
AF =

Trong đó:
W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: là khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic
đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic
Yêu cầu: trong định lượng yêu cầu hệ số bất đối xứng pic nằm trong
khoảng 0,8 - 2
 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột
N= 16 (




=
,.(
()

()
)

/

/ Trong đó:
t
(R)A
; t
(R)B
: là thời gian lưu của hai pic liền kề nhau A và B
11
W
A
; W
B
: là chiều rộng của pic đo ở đáy pic
W
1/2A
; W
1/2B
: độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao pic

- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc alkylamin –CH
2
NH
2
,
alkyl nitril –CH
2
CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân bố pha thuận để
12
phân tích các chất phân cực.
- R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng
cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R
của mạch carbon (C
2
;C
8
;C
18
) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm
OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt pha tĩnh trở
nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký phân bố pha
đảo để phân tích các chất không phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion.
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn
có những nhóm –OH tự do gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký
tùy theo môi trường pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH <2), thì có sự phân ly các nhóm
ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích
không thể tương tác với cột.
Trong môi trường base (pH >7), các nhóm OH trong cột sẽ
tương tác với chất tan có tính base. Trong tương tác này, khác với kiểu

một số nhóm
phân cực để tăng thêm độ phân cực của mạch C
18
làm cột có khả năng tách
chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh.
1.3.4.2 Lựa chọn pha động
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là
yếu tố thứ 2 quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký
pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril
hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng
nhỏ acid, muối, kiềm hoặc dung môi hữu cơ không phân cực.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng đến rất nhiều thông số của quá trình
14
sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu t
R
, độ phân giải R
s
, độ rộng pic nên
việc phân tích và lựa chọn pha động là rất quan trọng.
Yêu cầu của pha động:
 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian
 Hòa tan chất cần phân tích
 Có độ tinh khiết cao
 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
 Có tính kinh tế và ít gây ô nhiễm môi trường.
Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả:
 Bản chất của dung môi để pha pha động
 Thành phần các chất trong pha động
 pH của pha động
 Tốc độ dòng của pha động

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được
phân tích trong cùng một điều kiện. Nồng độ (hàm lượng) của chất chưa biết
được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra
từ đường chuẩn hoặc so sánh với chuẩn có nồng độ tương đương.
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn
ngoại, chuẩn hóa một điểm và đường chuẩn:
- Chuẩn hóa một điểm: chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất
thử. Tiến hành song song với nhau. Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn,
chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ chất thử.
- Phương pháp đường chuẩn: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có
nồng độ tăng dần, thường từ 5 - 7 điểm. Tiến hành sắc ký. Thiết lập mối
16
tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ chuẩn
Điều kiện áp dụng phương pháp đường chuẩn là trong khoảng nồng độ
khảo sát, chứng minh luôn có tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân
tích với diện tích pic của chất phân tích.

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG - HÓA CHẤT - THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Chế phẩm Kem VIEMDA AD của Trường Cao Đẳng Y Hà Nội (tuyp
20g, sản xuất ngày 25/04/2013, hạn dùng 2 năm kể từ ngày sản xuất) thuộc đề
tài cấp thành phố Hà Nội.
2.2 THIẾT BỊ - HÓA CHẤT
2.2.1 Thiết bị:
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent của Mỹ.
- Máy lắc xoáy tốc độ caoVortex mixer VM 300 của Đài Loan.
- Máy lắc siêu âm: Bandelin Sonorex super RK 106 của Đức.
- Nồi đun cách thủy Wisecircu của Tây Ban Nha.

định, áp suất cột đảm bảo, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý.
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm Kem
Viemda AD.
 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
 Thẩm định phương pháp phân tíchvới các tiêu chí thẩm định:
- Tính đặc hiệu của phương pháp
- Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Gentiopicrin và đáp ứng phân
tích (diện tích pic)

Trích đoạn Định lượng gentiopicrin trong mẫu thử kem Viemda AD

---