BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HUYỀN TRANG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CEFEPIM TRONG THUỐC
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ HUYỀN TRANG
huyết, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các kỹ thuật viên
ở bộ môn Hóa phân tích đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi
làm thực nghiệm tại bộ môn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động
viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện
đề tài này.

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Huyền Trang
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CEFEPIME 3
1.1.1 Công thức cấu tạo của cefepim 3
1.1.2 Tính chất lý hóa 3
1.1.3 Dược lý 4
1.1.4 Dược động học 5
1.1.5 Chỉ định 5
1.1.6 Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định 6
1.1.7 Liều lượng, cách dùng 6
1.1.8 Một số chế phẩm 7
1.2 . MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFEPIM 8
1.3 . SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 9
1.3.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 9
1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 9

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
4.1. KẾT LUẬN 40
4.2. KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatogtaphy).
mg Miligam
ml Mililit
PA Tinh khiết phân tích (Pure Analysis)
RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
USP 32 Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopoeia)
UV- Vis Tử ngoại- Khả kiến (Ultraviolet - Visible)
WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization ) DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Một số chế phẩm có chứa cefepim
7
1.2
Một số phương pháp định lượng cefepim bằng HPLC

Tên hình
Trang
1.1
Công thức cấu tạo của cefepim
3
3.1
Phổ hấp thụ tử ngoại của cefepim
24
3.2
Sắc ký đồ mẫu trắng
27
3.3
Sắc ký đồ mẫu cefepim chuẩn 0,5 mg/ml
27
3.4
Sắc ký đồ mẫu cefepim thử 0,5 mg/ml
28
3.5
Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn của cefepim
28
3.6
Độ tinh khiết của pic sắc ký của cefepim
29
3.7
Chồng phổ cefepim của dung dịch chuẩn và thử
30
3.8
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ
với diện tích pic của cefepim
33

2. Thẩm định phương pháp xây dựng.
2

3. Áp dụng định lượng một số chế phẩm có chứa cefepim đang lưu
hành ở Việt Nam.
3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ CEFEPIM
1.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của cefepim
 Công thức phân tử: C
19
H

4

Tạo sản phẩm có màu với H
2
SO
4
, HCHO/ H
2
SO
4
đặc [1], [2].

1.1.3. Dược lý
Cefepim là thuốc kháng sinh bán tổng hợp nhóm cephalosporin thế hệ
IV có phổ tác dụng rộng hơn các cephalosporin thế hệ III.
Thuốc được dùng theo đường tiêm (do bị phá hủy bởi dịch dạ dày và
hấp thu qua đường tiêu hóa hạn chế).
Thuốc có tác dụng kháng khuẩn do ức chế tổng hợp mucopeptid ở
thành tế bào vi khuẩn.
Các vi khuẩn nhạy cảm invitro với thuốc: Enterobacteriaceae,
Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Moraxella (branhamella)
catarrhalis, Neisseria onorrhoeae, các chủng Staphylococcus (trừ
Staphylococcus aureus kháng methicilin) và các chủng Streptococcus.
Cefepim không bị beta lactamase của các vi khuẩn Gram âm thủy phân
và có thể có tác dụng lên một số chủng Enterobacteriaceae và P. aeruginosa
kháng cefotaxim hay ceftazidin.
Cefepim có tác dụng lên các vi khuẩn Gram dương (ví dụ
Staphylococcus) mạnh hơn ceftazidin và có tác dụng tương tự như ceftriaxon.
Thuốc có tác dụng yếu lên vi khuẩn kỵ khí, nhất là Bacteroides
fragilis.

kèm theo).
 Viêm phổi nặng có kèm theo nhiễm khuẩn huyết do các chủng nhạy
cảm với thuốc.
 Nhiễm khuẩn nặng ở da và cấu trúc của da do các chủng
Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicilin và do các chủng
Staphylococcus pyogenes nhạy cảm với cefepim [1], [13].
6

1.1.6. Tác dụng không mong muốn, chống chỉ định
1.1.6.1. Tác dụng không mong muốn
 Thường gặp ADR>1/100: Ỉa chảy, phát ban.
 Ít gặp 1/1000<ADR< 1/100: Sốt, nhức đầu, buồn nôn, nôn, mày đay,
mẩn ngứa, tăng bạch cầu ưa acid, giảm bạch cầu hạt, viêm tắc tĩnh mạch (nếu
tiêm tĩnh mạch), bệnh nấm Candida ở miệng, tăng các enzym gan .
 Hiếm gặp ADR<1/1000: Phản ứng phản vệ, phù, chóng mặt, giảm bạch
cầu trung tính, hạ huyết áp, dãn mạch, đau khớp [1], [13].

1.1.6.2. Chống chỉ định
 Người bệnh dị ứng với kháng sinh nhóm cephalosporin [1], [13].

1.1.7. Liều lượng, cách dùng
1.1.7.1. Cách dùng
 Tiêm tĩnh mạch chậm 3 - 5 phút hoặc truyền tĩnh mạch, hoặc tiêm bắp
sâu và liều lượng cefepim tùy theo mức độ nặng nhẹ từng trường hợp.
 Truyền tĩnh mạch ngắt quãng: Pha bằng dung dịch natri clorid 0,9%,
dextrose 5%, Ringer lactat và dextrose 5% có nồng độ thuốc tương ứng là 10,
20 hay 40 mg/ml. Ngoài ra, pha với dịch truyền tĩnh mạch để có dung dịch có
nồng độ thuốc tương ứng vào khoảng 100 hay 160 mg/ml. Liều thuốc cần
dùng sẽ được tính và cho vào dịch truyền tĩnh mạch. Thực hiện việc truyền
tĩnh mạch ngắt quãng trong khoảng xấp xỉ 30 phút.

tiêm
Công ty CPDP
Euvipharm
2
Cepas
Cefepim
Bột pha
tiêm
Samrudh
Pharmaceuticals PVT.
Ltd, Ấn Độ.

3
Maxipime
Cefepim
Bột pha
tiêm
Bristol – Myers
Squibb, USA
4
Scud- XP
Cefepim +
Tazobactam
Bột pha
tiêm
Zuventus Healthcare
Ltd., India
5
Magnova
Cefepim

[16]
C18 (4,6 х
250 mm, 5
µm)
Đệm phosphat pH
6,2: Acetonitril
(94:6, v/v)
20 µl
210nm
1ml/ph
[17]
C18 (3,9
mm х 30
cm, 5 µm)
Natri
pentanesulfonat:
acetonitril (94:6, v/v)
10 µl
254 nm
2ml/ph

1.8.2. Phương pháp khác định lượng cefepim

Bảng 1.3: Một số phương pháp định lượng cefepim bằng Quang phổ
UV.

Tài
liệu
Nhà nghiên
cứu

UV-1800 ,
cuvet thạch
anh 1cm
Hòa tan và pha
loãng với
methanol
295 nm và
288,8 nm
tương ứng
với cefepim
và
moxifloxacin
9 [11]
Chafle D. M Chất tạo phức
màu đỏ với
1,10
phenonthroline
trong sự có mặt
của sắt nitrat
515 nm

1.3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Khái niệm :
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở

 Sự chảy dung môi không tạo ra các xung (pulse).

1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường làm bằng thủy tinh đôi khi bằng thép
không gỉ. Dung môi cần lọc qua màng lọc 0,45 µm và đuổi khí hòa tan trong
dung môi (thường sử dụng máy siêu âm).
Phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần 1 bình dung môi. Phương
pháp rửa giải gradient cần nhiều bình chứa các dung môi khác nhau.

1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu: Phương pháp phổ biến dùng van tiêm
có vòng chứa mẫu có dung tích xác định, chính xác, có thể thay đổi vòng
chứa mẫu với các dung tích khác nhau.
Một số máy HPLC có hệ tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển
thể tích mẫu, số lần tiêm, chu kỳ rửa vòng chứa mẫu.

1.3.3.4. Cột sắc ký
11

Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột thường được làm bằng các
chất trơ về mặt hóa học, chịu được áp suất cao, hiện nay thông dụng nhất là
thép không gỉ. Ở quy mô phân tích, chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường
kính trong từ 4-10 mm.
Chất mang (pha tĩnh) được nhồi trong cột. Các tiểu phân pha tĩnh được
chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau: silca (silic dioxyd), nhôm oxyd, polyme
xốp, và hiện nay thường dùng các tiểu phân có kích thước 3- 10 µm. Tùy
từng loại pha tĩnh khác nhau có các loại sắc ký khác nhau: sắc ký hấp phụ, sắc
ký trao đổi ion, sắc ký phân bố,
Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp các dung môi. Ái lực của
một chất với pha tĩnh hay thời gian lưu của nó trên cột phụ thuộc vào độ phân

Thời gian lưu phụ thuộc :
 Bản chất của pha tĩnh.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
 Cấu tạo, bản chất của phân tử chất tan.
 Trong một số trường hợp t
R
phụ thuộc vào pH pha động.

1.3.4.2. Thể tích lưu (V
R
)
Thể tích lưu của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra
khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên
sắc ký đồ.
V
R
= t
R
х F (1.1)
Trong đó t
R
: Thời gian lưu.
F: Lưu lượng của pha động.

1.3.4.3. Hệ số phân bố (K)
13

Hệ số phân bố là tỷ lệ nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ chất
tan trong pha động.
K =



 












Trong đó: Q
s
, Q
M
: Lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.
V
S,
V
M
: Thể tích của pha tĩnh, pha động.
K: Hệ số phân bố.
t
R,
t
0



(1.5)
Trong đó L: Chiều dài cột sắc ký.
H: Chiều cao của đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.

1.3.4.6. Hệ số bất đối xứng (AF)
AF=


 (1.6)
Trong đó a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.
W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu 0,8 ≤AF≤ 1,5.

1.3.4.7. Độ phân giải (R
S
)









 

Trong đó t
RA
, t
RB
: Thời gian lưu của hai pic liền kề nhau.
W
A
, W
B
: Chiều rộng đo ở đáy của hai pic.
15

W
1/2(A)
, W
1/2(B)
: Độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của
chất A, B.
R
S
= 1,5 hai pic tách khỏi nhau rõ ràng.
R
S
= 1,0 hai pic chưa tách hẳn, còn xen phủ nhau.
R
S
= 0,75 hai pic chưa tách hẳn.

1.3.5. Ứng dụng của HPLC [3], [7]
1.3.5.1. Định tính

: Diện tích pic của chất thử, chất chuẩn.
C
T
, C
S
: Nồng độ chất thử, chất chuẩn.
16

Chuẩn ngoại nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn có nồng độ tăng
dần và nằm trong khoảng tuyến tính. Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích, chiều
cao pic. Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa
nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic. Dựa vào phương trình tính nồng độ
chất thử.
 Phương pháp chuẩn nội: Thêm một lượng bằng nhau một chất chuẩn
thứ hai (được gọi là chất chuẩn nội) vào trong cả mẫu thử và mẫu chuẩn, tiến
hành sắc ký trong cùng điều kiện.
Yêu cầu cần có của một chất chuẩn nội:
 Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn
toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu
thử.
 Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.
 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
 Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
 Có nồng độ xấp xỉ nồng độ chất thử.
 Phương pháp thêm chuẩn
Áp dụng trong định lượng bằng HPLC khi có ảnh hưởng của các chất
hấp phụ.
Thêm chính xác các lượng chất chuẩn đã biết nồng độ vào cùng một
lượng mẫu thử, tiến hành sắc ký.
Xây dựng phương trình đường thẳng thể hiện mối tương quan giữa