BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
DƢƠNG QUỲNH TRÂM
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
DƢƠNG QUỲNH TRÂM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
METHAMPHETAMIN TRONG TÓC
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Lê Minh
2. ThS. Phạm Quốc Chinh
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia

HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS. Phạm Lê Minh, giảng viên

1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 5
1.2.2. Tác dụng dược lý 5
1.2.3. Dược động học và phân bố trong tóc 7
1.3. Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc 9
1.3.1. Cấu trúc của tóc 9
1.3.2. Các phương pháp chiết methamphetamin trong tóc 9
1.4. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 10
1.4.1. Khái niệm 10
1.4.2. Hệ thống GC-MS 11
1.4.3. Một số kỹ thuật MS 14
1.5. Các phương pháp xác định methamphetamin trong tóc 15
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ 15
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 15
1.5.3. Phương pháp miễn dịch 15
Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 16
2.1. Nguyên liệu, thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc 17
2.2.2. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu thực 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu nghiên cứu 17
2.3.2. Pha các dung dịch chuẩn 17
2.3.3. Xử lý mẫu, chiết và tạo dẫn xuất 18
2.3.4. Định lượng methamphetamin trong mẫu tóc 19
2.3.4.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký 19
2.3.4.2. Lựa chọn nội chuẩn 19
2.3.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích 19
2.3.5. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng MA trong mẫu tóc 20

2,5-Dimethoxyamphetamin
ELISA
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)
GC-FID
Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatography – Flame
Ionization Detector)
GC-MS
Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography–Mass Spectrometry)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
KLPT
Khối lượng phân tử
LC-MS
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)
LOQ
Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)
MA
Methamphetamin
MDA
3,4-Methylendioxyamphetamin
MDMA
3,4-Methylendioxymethamphetamin
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
TFAA
Trifluoroacetic anhydrid



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trường ma túy Việt Nam
4
1.2
Cơ chế tác dụng lên thần kinh trung ương của MA
7
1.3
Sơ đồ chuyển hóa của MA
8
1.4

26
3.6
Sắc ký đồ mẫu tóc trắng sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và
mảnh 154 (dưới)
27
3.7
Sắc ký đồ TIC mẫu tóc trắng + chuẩn
27
3.8
Sắc ký đồ mẫu tóc trắng + chất chuẩn sau xử lý tách ion với mảnh
144 (trên) và mảnh 154 (dưới)
28
3.9
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (tỷ số
diện tích pic MA/AM-d5) với hàm lượng mẫu nhiễm
29
3.10
Sắc ký đồ TIC mẫu Quách Trường S
33
3.11
Sắc ký đồ của mẫu Quách Trường S sau xử lý tách ion với mảnh 144
(trên) và 154 (dưới)
33
3.12
Sắc ký đồ TIC của mẫu Nguyễn Văn M
34
3.13
Sắc ký đồ của mẫu Nguyễn Văn M sau xử lý tách ion với mảnh 144
(trên) và mảnh 154 (dưới).
34

2

1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng MA trong tóc bằng kỹ thuật
GC-MS.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy
để xác định MA trong tóc và áp dụng vào mẫu tóc thực tế.
3

Chƣơng 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về nhóm ATS
ATS là từ viết tắt của amphetamine type stimulants – các chất kích thích thần
kinh dạng amphetamin – bao gồm nhiều chất có cấu trúc tương tự nhau, trong đó

CH
NH
R
5
R
6

4 Hình 1.1. Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trƣờng ma túy Việt Nam
Bảng 1.1. Công thức một số ATS điển hình
Dẫn chất amphetamin
R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
R
6
Amphetamin
H
H
H
H

3
3,4-methylendioxy-N-
ethylamphetamin
H
*
*
H
CH
3
C
2
H
5
4-methoxyamphetamin
H
H
OCH
3
H
CH
3
H
2,5-dimethoxyamphetamin (DMA)
OCH
3
H
H
OCH
3
CH

H
5
OCH
3
CH
3
H
4-Bromo-2,5-dimethoxyamphetamin
OCH
3
H
Br
OCH
3
CH
3
H
Ghi chú: kí hiệu * là giữa C3và C4 của nhân thơm có liên kết –OCH
2
-O-
5

1.2. Tổng quan về methamphetamin
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa [5][6][13]
MA thường gặp dưới 2 dạng là base và muối hydroclorid
 Methamphetamin base:
CH
2
CH
N

1.2.2. Tác dụng dược lý
Tác dụng kích thích thần kinh của MA là rất nhanh, thậm chí có ngay trong
khi tiêm. Thời gian tác dụng có thể kéo dài 4-8 giờ ở người chưa nghiện và 2-3 giờ
ở người nghiện. Sự khác biệt về hiệu quả giữa nam và nữ, giữa các lứa tuổi là
không đáng kể. Tác dụng kích thích thần kinh của MA tăng lên khi kết hợp với một
số thuốc khác như ephedrin, cocain, các chất giảm đau nhóm opiat, các thuốc ngủ
[4][6][17]. Sau đây là một số tác dụng dược lý và cơ chế của MA:
 Tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương:
MA tác dụng chủ yếu lên não, vỏ não, ngoài ra còn tác dụng lên hệ thống
lưới hoạt hóa của hệ thần kinh trung ương. Các tác dụng này gây ra những thay đổi
6

trạng thái tinh thần như cảm giác sảng khoái, tỉnh táo, phấn chấn, tinh thần nhanh
nhẹn, tăng tính năng động, tự tin, tăng vận động, nói năng, giảm mệt mỏi, dịu đau.
Các trạng thái này có thể giúp cho con người cải thiện được những công việc đơn
giản, thậm chí làm được nhiều việc hơn, nhất là những vận động thể chất như điền
kinh, nhảy múa,…tuy nhiên với các công việc phức tạp thì hiệu quả giảm và khả
năng sai sót trong công việc tăng do thiếu năng lực tập trung. Do các tác động lên
thần kinh như trên, người sử dụng MA có xu hướng tiếp tục sử dụng hết lần này đến
lần khác để thỏa mãn kích thích bản thân và dần lệ thuộc vào nó, đó là sự nghiện
MA. Việc dùng MA kéo dài hoặc liều cao thường gây chán chường, mệt mỏi, ảo
giác, hoang tưởng, hoảng loạn, đau đầu, chóng mặt, rối loạn vận mạch, lẫn lộn, suy
nhược tinh thần, suy giảm khả năng tình dục [4][6][17].
 Tác dụng kích thích hệ thần kinh giao cảm [6][9][17]:
MA có tác dụng kiểu α và β như các chất cường giao cảm:
- Tác dụng lên tim mạch: kích thích trực tiếp làm tăng nhịp tim, gây co mạch,
làm tăng huyết áp cả tâm thu lẫn tâm trương. Dùng liều lớn có thể gây loạn
nhịp tim, co thắt mạch vành gây đau thắt ngực.
- Tác dụng lên các cơ trơn khác: làm giảm co thắt cơ trơn dạ dày, ruột, giảm
chuyển dịch thức ăn.

dạng không biến đổi, khoảng 15% ở dạng 4-hydroxymethamphetamin, khoảng 5%
ở dạng amphetamin và một số chất chuyển hóa khác ở dạng biến đổi hoặc kết hợp
[5][12].
Về sự phân bố trong tóc, cơ chế của nó rất phức tạp và hiện nay vẫn chưa rõ
ràng, nhiều giả thuyết cho rằng MA đã khuếch tán (thụ động hay chủ động) từ các
mạch máu nuôi dưỡng nang tóc vào nang tóc, nằm chủ yếu ở tủy tóc. MA tồn tại
trong tóc trong vài tháng đến thậm chí hàng năm [17][19][30].

Hình 1.4. Giả thuyết
cơ chế MA đi vào
trong tóc
9

1.3. Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc
1.3.1. Cấu trúc của tóc
Sợi tóc gồm 2 phần là nang tóc và thân tóc.
Nang tóc còn gọi là chân tóc, nằm phía dưới bề mặt da sâu từ 3-5mm. Nó
được bao quanh bởi hệ thống mao mạch máu nuôi dưỡng tóc. Nang tóc là phần
“sống” duy nhất của tóc, giúp tóc mọc dài ra. Thân tóc là những “sợi tóc” mà ta
nhìn thấy hằng ngày, là phần tóc đã “chết” [18][25].
Thân tóc gồm 3 lớp: lớp biểu bì (cuticle), lớp giữa (cortex) và lớp tủy
(medulla). Lớp biểu bì là phần ngoài cùng, gồm các lớp keratin trong suốt xếp
chồng lên nhau như vảy cá, có tác dụng bảo vệ sợi tóc khỏi hóa chất và những ảnh
hưởng bên ngoài. Lớp biểu bì còn được phủ một màng lipid mỏng để tóc không
thấm nước. Lớp giữa bao gồm nhiều bó sợi nhỏ hợp thành và chứa các sắc tố của
tóc. Lớp tủy là phần trong cùng của sợi tóc, chứa các hạt chất béo và không khí
[11][18][25].

Hình 1.5. Cấu trúc của tóc
1.3.2. Các phương pháp chiết methamphetamin trong tóc [11][18][21][25][29]

còn gọi là sắc ký khí hấp phụ, nhưng vì quá trình hấp phụ có nhiều hạn chế nên
GSC ít được ứng dụng ngoại trừ phân tích một số chất khí [2][35].
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các
chất. Kỹ thuật này là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử dụng trong nhiều lĩnh
vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ [2][28].
Sự kết hợp hai kỹ thuật trên, GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký khí
khối phổ GC-MS. Phương pháp GC-MS sử dụng kĩ thuật GC để tách các chất và
11

phát hiện chúng với detector MS nhờ đó phát huy được ưu điểm của cả hai phương
pháp, phát triển và mở rộng ứng dụng của hai kĩ thuật này
1.4.2. Hệ thống GC-MS

Hình 1.6. Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển
chất phân tích qua cột. Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo
yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector.
Một số loại khí mang thường dùng là heli, nitơ, hydro, argon,…
Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng
khí [2][28][35].
 Buồng tiêm mẫu
Mẫu phân tích lỏng hoặc khíđược tiêm nhanh vào dòng pha động với một
lượng vừa đủ bằng bơm tiêm nhỏ hoặc van tiêm mẫu. Cỡ mẫu thường thay đổi từ
vài µl đến 20µl. Mẫu được tiêm qua đệm silicon chịu nhiệt vào buồng hóa hơi,
buồng này được đốt nóng tới nhiệt độ thích hợp và nối với cột tách [2][28][35].
Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau.
 Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ thuật tiêm mẫu sau:
- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:100 đến 1:1000 để

- Khí mang: heli hoặc hydro.
- Độ phân giải: phân tích nhiều thành phần: 100 chất hoặc hơn, nhất là với
cột đường kính trong <0,2mm. Chất tan được rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn
so với cột nhồi.
 Cột nhồi:
13

- Nguyên liệu: thủy tinh, thép không gỉ.
- Kích thước: dài 1-3m (cuộn tròn). Đường kính trong 2-3mm.
- Pha tĩnh: kích thước hạt 150-250µm, được bao lớp mỏng (0,05-1µm).
- Khí mang: nitơ, heli.
- Độ phân giải: thấp, tốt nhất chỉ có thể tách được 20 thành phần.
 Pha tĩnh: pha tĩnh sử dụng chủ yếu là chất lỏng và được cố định trong cột cần
đảm bảo yêu cầu sau:
- Áp suất hơi thấp, tức là điểm sôi cao, ít nhất là cao hơn 100
0
C so với nhiệt
độ vận hành cực đại của cột.
- Bền với nhiệt độ.
- Trơ về mặt hóa học.
- Đặc tính dung môi đảm bảo hệ số k’ và α của chất phân tích nằm trong
khoảng thích hợp
Một số pha tĩnh lỏng dùng cho sắc ký khí- lỏng như: polydimethyl siloxan
(100% methyl), poly (phenyl methyl) siloxan (50% phenyl), poly (trifluoropropyl
dimethyl) siloxan, polyethylen glycol,… [2][35]
 Detector khối phổ
Detector khối phổ là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện khối phổ
còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng
của chúng.
Nguyên tắc hoạt động: Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia

được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN). FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất
phân tích hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn [2][4][5].
 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, SelectedIon Monitoring)
15

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc ký đò theo
thời gian. Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng
độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N) [2][4][5].
1.5. Các phương pháp xác định methamphetamin trong tóc
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp sắc ký khí khối phổ ngày càng được sử dụng rộng rãi trong
phân tích MA. Máy sắc ký khí tách MA và đưa vào detector khối phổ, có khả năng
định tính, định lượng MA với độ nhạy và độ chính xác cao. Để sử dụng phương
pháp này, MA cần được tạo dẫn xuất để tăng khả năng bay hơi và bền với điều kiện
sắc ký [16][18][20][27][30][34].
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng là một phương pháp đã được sử
dụng nhiều để phát hiện MA. Với mẫu tóc, chiết MA bằng phương pháp thích hợp
rồi đưa vào hệ thống LC-MS mà không cần tạo dẫn xuất như với GC-MS. Bộ phận
LC có chức năng chia tách MA trong dung dịch, đưa vào bộ phận khối phổ với vai
trò detector để định tính , định lượng [18][22][23][30].
1.5.3. Phương pháp miễn dịch
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng kháng thể đặc hiệu với chất cần
phân tích (kháng nguyên) và dạng đánh dấu của chất phân tích. Dạng đánh dấu của
chất phân tích sẽ tranh chấp với chất phân tích để kết hợp với kháng thể theo cơ chế
phản ứng giữa kháng nguyên với kháng thể. Kết quả là số lượng các phân tử bị đánh
dấu sẽ tỷ lệ nghịch với lượng chất cần phân tích trong mẫu. Tùy thuộc vào bản chất
của chất đánh dấu mà các phương pháp phân tích sẽ được áp dụng. Phương pháp
này thường ứng dụng để tạo các kit xác định nhanh MA. Mẫu tóc sau khi được xử
lý và chiết sẽ được đem xác định bằng phương pháp miễn dịch để phát hiện MA

 Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc bằng GC-MS: bao gồm các
nội dung
- Xử lý mẫu: đưa ra quy trình xử lý mẫu chiết lỏng lỏng sau khi thủy phân
trong môi trường kiềm.
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội: đưa ra chương trình sắc ký
khối phổ để định lượng, chất chuẩn nội phù hợp.
 Thẩm định phương pháp: bao gồm các nội dung
- Tính phù hợp hệ thống sắc ký
- Tính chọn lọc – độ đặc hiệu
- Độ tuyến tính
- Độ đúng
- Độ chính xác
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
2.2.2. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu thực
Sử dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích MA trong mẫu tóc của
người nghi ngờ sử dụng ma túy gửi đến giám định tại Khoa Pháp y – Viện Pháp y
quốc gia.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Lấy mẫu,chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Mẫu tóc được gửi đến hoặc lấy trực tiếp ở Khoa Hóa pháp - Viện Pháp y
quốc gia, đựng trong túi polyme sạch, bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 0-4
o
C.
2.3.2. Pha các dung dịch chuẩn
 Dung dịch chuẩn MA trong methanol 1µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch
chuẩn MA 1mg/ml vào bình định mức 100ml, thêm lượng methanol vừa đủ
vào, lắc đều.

Trích đoạn Ứng dụng phân tíchMA trong mẫu tóc thực

---