BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG
1,3,4-THIADIAZOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐỖ THỊ MAI DUNG
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID
HYDROXAMIC MANG KHUNG
1,3,4-THIADIAZOL
Đỗ Thị Mai Dung
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2
1.1.2. Phân loại các HDAC 3
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 4
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 8
1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 9
1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 9
1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 10
1.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID
HYDROXAMIC 13
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALL :
Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính
AML :
Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính
APL
CDI
CLL
CTCL
:
:
:
:
Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính
Carbonyldiimidazol
Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia)
H
IC
50
:
Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa
IR
MTT
:
:
Phương pháp phổ tử ngoại
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
MeOH :
Methanol
MS
NSCLC
:
:
Phổ khối lượng
Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell)
NST :
Nhiễm sắc thể
SAHA :
Acid suberoylanilid hydroxamic
T
ả
ng 1.2:
Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol-
hydroxamic 13
3
B
ả
ng 3.1:
Kết quả docking của các chất
5a
-
f
với HDAC8 20
4
B
ả
ng 3.
2
:
Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid
hydroxamic từ ester 33
5
B
ả
ng 3
.3:
Giá trị R
f
và nhiệt độ nóng chảy của các chất
5a
-
f
37
9
B
ả
ng 3.7:
Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
5a
-
f
37
10
B
ả
ng 3.8:
Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
5a
-
f
39
11
B
ả
ng 3.8:
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất
2
Hình
1.
2
:
Mô tả đặc điểm của các loại HDAC 4
3
Hình
1.
3
:
Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào
ung thư 6
4
Hình
1.
4
:
Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm
sàng 7
5
Hình
1.
5
:
Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của
HDAC 9
6
Hình
1.6:
5a
-
f
với HDAC8 21 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT
Tên sơ đồ Trang
1
Sơ đ
ồ
1.
1
:
Cơ chế xúc tác của CDI 14
2
Sơ đ
ồ
3.1:
Quy trình tổng hợp chung 21
ồ
3.5:
Quy trình tổng hợp chất
5a
25
7
Sơ đ
ồ
3.6:
Quy trình tổng hợp chất
5b
26
8
Sơ đ
ồ
3.7:
Quy trình tổng hợp chất
3b
27
1
1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid và 5
dẫn chất.
2. Thử độc tính tế bào và tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
Tất cả bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp
đại phân tử protein-ADN. Nhiễm sắc thể có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao
gồm: ADN, các protein histon và protein không phải histon. Đơn vị cấu trúc cơ bản
của NST là nucleosom. Một nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa
của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn
quanh bởi 146 cặp nucleotid [1,48] (hình 1.1):
Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom
Khi đầu amin của histon tích điện dương sẽ tương tác với phần phosphat mang
điện âm trên phân tử ADN làm đóng xoắn NST gây ức chế dịch mã và tổng hợp
protein, làm ức chế sự biển hiện gen. Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu
NST tháo xoắn , quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện
thông qua các tính trạng. Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua
quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon liên quan đến hoạt động của 2
emzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT).
1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase
ở đáy túi. Do đó
những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo phức với Zn
2+
như các acid
hydroxamic, các thiol… Ngược lại các sirtuin không bị ức chế bởi các hợp chất tạo
chelat với Zn
2+
vì cơ chế hoạt động của chúng phụ thuộc vào NAD
+
như 1 cofactor
thiết yếu [43]. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được sử dụng cho những
hợp chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển và những hợp chất này đang
được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau.
H
A
T
s
H
D
A
C
s
4 Ghi chú: Vùng xúc tác
Vùng tín hiệu nhận diện nhân tế bào
Hình 1.2: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC
1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC
chế được điều khiển bởi protein gắn kết CBFb-SMMHC thông qua sự gia tăng phức
hợp đồng ức chế mSin3A/HDAC. Cuối cùng, biểu thị quá mức nhân tố sao mã
SCL/Tal1 trong bệnh u lympho tế bào T cấp có nguyên nhân là do gia tăng bất
thường HDAC1 nằm trong phức hợp đồng ức chế, dẫn đến ngăn cản gen đích điều
hòa E47/HEB [14]. Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6
còn gặp trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ
dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [23,45,47] cũng như trong các bệnh lý ác
tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T
ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [37]. Hơn nữa,
việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, E2F, Rb, Bcl6, Gli1 liên
quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của
6
HDAC trong ung thư [12,36]. Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể
làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này
liên quan đến quá trình phiên mã của các gen gây ung thư.
Các nghiên cứu có tính thống kê còn chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến
nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu
trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình kể cả sự xâm lấn, sự di
chuyển và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học
của tế bào ung thư được tóm tắt trong hình 1.3 [9,20,28,44].
Như vậy ức phiên mã được điều hòa bởi sự ra tăng HDAC và có thế kiểm soát
ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC. Các chất ức chế HDAC đã và đang
được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức
chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư. Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
Lo
ạ
i ung thư
Acid
carboxylic
Butyrat
AN-9 (tiền thuốc)
Acid valproic
Phenyl butyrat
I, II
I, II
I, II
I
Ung thư đại tràng
Tạng đặc, NSCLC
Tạng đặc, ung thư máu, AML,
MDS, CTCL, u trung biểu mô
Tạng đặc, AML/MDS
Acid
hydroxamic
SAHA
PXD101
NVP-LAQ824
LBH-589
ITF-2357
SB-939
CRA 024781
I, II Tạng đặc, CLL, AML, u đa tủy
xương, NHL tế bào T ngoại vi, RAI
kháng thyroid, ung thư đại tràng
tiến triển
Ghi chú: NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML: ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS:
hội chứng loạn sản tủy; CTCL: u lympho da tế bào T; ALL: ung thư bạch cầu cấp; CLL: ung thư
bạch cầu mãn.
1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Cấu trúc của các chất ức chế HDAC rất đa dạng nhưng nhìn chung đều gồm 3
phần chính:
- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface
recognition group): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt
enzym.
- Vùng cầu nối sơ nước: thường là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng
hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với kênh
enzym.
9
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): tương tác với ion
Zn
2+
tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm
o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton
Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và
một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống
trong lòng kênh enzym. Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với phần
vành trên bề mặt miệng túi enzym. Nhóm nhận diện bề mặt có thể liên kết với phần
cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần
cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC. Việc nghiên cứu thiết kế cấu
tác dụng ức chế HDAC yếu hơn TSA song tương tự oxamflatin [29].
Hình 1.6: Cấu trúc của TSA, oxamflatin và các dẫn chất N-hydroxy-2-propenamid
- Các amid ngược của SAHA
Nhóm nghiên cứu thuộc công ty Topo Target (Anh) đã thiết kế và tổng hợp
gần 40 dẫn chất amid ngược của SAHA (hình 1.7) [6]. Nhiều chất trong số này có
hoạt tính ức chế HDAC tương đương thậm chí mạnh hơn SAHA. Trong đó có 2
chất đã được thử nghiệm mô hình ung thư in vivo trên chuột cho kết quả khả quan,
định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo.
11 Hình 1.7: Các dẫn chất amid ngược của SAHA
- Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA
Nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đã
thiết kế và tổng hợp dãy dẫn chất ω-alkoxy của SAHA (hình 1.8) [24]:
Hình 1.8: Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA
Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn xuất ω-
alkoxy của SAHA đều cho giá trị IC
50
ở mức rất thấp (0,05 - 0,5 µM). Độc tính của
các chất với tế bào ung thư thể hiện mạnh hơn so với SAHA trên cả 3 dòng tế bào
NB4 (ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp), H460 (ung thư phổi người), HCT-116
(ung thư đại tràng).
1.3.2.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động
- Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA
Viện nghiên cứu Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất
acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí phenyl của SAHA
50
trung bình khoảng 150 nM, thấp nhất là 25 nM (bảng 1.2). 13
Bảng 1.2: Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol-hydroxamic
Chất Ar
IC
50
(nM)/HDAC
HDAC1
HDAC2
HDAC3
HDAC6
HDAC10
I
dụng nhất trong nhóm. Victor Andrianov và cộng sự đã dùng CDI để xúc tác phản
ứng tạo amid cho hiệu suất cao [6], phương trình phản ứng tổng quát như sau:
RCOOH + R
1
NH
2
RCONHR
1
Cơ chế xúc tác của CDI được biểu diễn trong sơ đồ 1.1:
Sơ đồ 1.1: Cơ chế xúc tác của CDI
1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Có nhiều cách khác nhau để tổng hợp acid hydroxamic từ ester nhưng hay
dùng nhất là sử dụng KCN hoặc NaOH làm xúc tác. Các phản ứng có phương trình
như sau [5,13,16,24]:
Với điều kiện hóa chất, dung môi tại phòng thí nghiệm và tham khảo tài liệu,
chúng tôi lựa chọn xúc tác NaOH và dung môi MeOH để tiến hành phản ứng này.
15
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital) để xác định
nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ HP 5989B-MS để ghi phổ MS.
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR.
16
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học
* Nghiên cứu Docking với 6 acid hydroxamic dự kiến tổng hợp.
* Tổng hợp 6 acid hydroxamic:
- N
1
-hydroxy-N
8
-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid (5a).
- N
1
-{5-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3,4-thiadiazol-2-yl}-N
8
-
hydroxyoctandiamid (5b).
- N
1
tác với SAHA [26]. Cấu trúc của HDAC8 có điểm tương đồng cao với HDAC4 với
điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-mean-
square deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC
của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian được nghiên cứu kỹ nhất. Chúng
tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chương
Copyright: Tài liệu đại học ©