BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH
HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN
THẢO DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HẢI YẾN


Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên
và ủng hộ tôi trong suốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời
gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013
Tác giả
Nguyễn Thị Hải Yến
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ….………………………………………………………………… 1
Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành
nhận diện thảo dược…………………………………………………………… … 3
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược……………………………… ……3
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược…… …….4
1.2.1. Phương pháp hình thái…………………………………………………… 4
1.2.2. Phương pháp vi học………………………………………………… ……5
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6
Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
nhận diện thảo dược……………………………… ……………………………… 9
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)……… ……… ….10
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN
có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)… ………………………………… 13
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)…… …14
2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
B
ả
ng

Tên

Trang

1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29

2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học
phân tử để nhận diện thảo dược
55

Hình
1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch
đại ngẫu nhiên – RAPD
11

2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia,
S. sophera, S. tora
12

3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16

4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18


từ marker RAPD)
11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax
notoginseng
28

12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32

13

Sơ đ
ồ

vùng ITS và v
ị

trí các m
ồ
i đư
ợ
c s
ử

d
ụ
ng

34

14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel

chain reaction
Kĩ thuật PCR với mồi tùy
chọn
ARMS Amplification refractory mutation
system
Kĩ thuật khuếch đại hệ thống
đột biến bền vững
AS-PCR Allele specific - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng
cho allel
ATP-P
33
Adenosine triphosphate -
phosphorus
33BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò
C Cytosine
CAPS Cleaved amplified polymorphism
sequence
Kĩ thuật sự đa hình các trình
tự khuếch đại được phân cắt
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại
ADN
DALP Direct amplification of length
polymorphisms
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài

polymorphism
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
các đoạn giới hạn
RP-PCR Random primed - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu
nhiên
SCAR Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc regions trưng
SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid
SSCP Single strand conformation
polymorphism
Sự đa hình hình dạng sợi đơn
SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản
T Thymine
UV Ultraviolet Vùng tử ngoại
WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài
thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều
ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong
lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới
(WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc

Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo
dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử
trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực
hiện với mục đích:
- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận
diện thảo dược.
- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật
sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược.
3

Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo
dược
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược
Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài
dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng
thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một
yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng
tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng
nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh
doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên
nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác
dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung
tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do
dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi
có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này
là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong
suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là

cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng
chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay
bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng
hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ
chùm, thân rễ hay thân hành) [63].
Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là
dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để
nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử
dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu
không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với
5

nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại
cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69]. Bên cạnh cách thức mô tả như trong
Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như
đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà…
Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu
quan tâm [81].
Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn
giản nhất, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh
nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần
như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81]. Bên
cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không
thể thực hiện được. Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược
điểm này.
1.2.2. Phương pháp vi học
Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu
cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào. Khi thảo dược ở dạng
chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi. Phương pháp vi học thích
hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã

[81]. Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này.
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học
Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về
thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó. Các phương pháp
phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện
di và phương pháp quang phổ [81].
Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một
thảo dược. Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa
7

học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó. Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc
ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau
hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau. Tuy
nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau. Một số
hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược.
Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện
thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52].
Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo
dược do có khả năng tách tốt [31]. Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và
Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược
thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế.
Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được
sử dụng trong nhận diện thảo dược. Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng
phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học
được chiết xuất từ mẫu quan tâm. Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63].
Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ
rất hữu ích trong nhận diện thực vật. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ
thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học
của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và

di truyền. Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời
gian. Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện
có. Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong
thời gian ngắn [2].
Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử
ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi
liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33]. Tất cả các ADN
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của
những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch
mới [2].
Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được
các marker ADN khác nhau. Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu
cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định
trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26]. Sau bước khuếch đại
10

nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ
được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78].
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ
thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn
mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra
các đoạn ADN đặc trưng. Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN
khuôn để khuếch đại. Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt
của một băng điện di nhất định [78].
Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily
primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu
nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch
đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF). Với các kĩ thuật khác nhau thì

S. tora [37]
Mồi OPC-3 (hàng: 1–8), mồi OPC-4 (hàng: 9–16). S. angustifolia (hàng: 1, 2, 9,
10), S. acutifolia (hàng: 3, 4, 11, 12), S. sophera (hàng: 5, 6, 13, 14), S. tora (hàng:
7, 8, 15, 16). Thang ADN 100 bp và 1 kb .
Qua nghiên cứu này, kĩ thuật RAPD bộc lộ ưu điểm là nhanh, dễ thực hiện.
Bên cạnh đó, lượng mẫu yêu cầu là rất nhỏ, tính bằng đơn vị nanogram (lượng
ADN cần là 30ng/µl), trong thử nghiệm không sử dụng bất kì chất phóng xạ nào
nên rất an toàn. Ngoài ra, kĩ thuật RAPD còn không yêu cầu bất kì thông tin nào của
bộ gen cần nghiên cứu.
Bên cạnh những ưu điểm trên, RAPD cũng cho thấy nhược điểm là độ lặp lại
(reproducibility) thấp. Phản ứng RAPD-PCR chịu ảnh hưởng rất nhiều về điều kiện
phản ứng, độ sạch của mẫu. Trong nghiên cứu với Senna angustifolia và các loài
thân thuộc, để khắc phục nhược điểm này, các tác giả chỉ xem xét các băng rõ ràng
và tin cậy. Cùng với đó, quá trình chuẩn hóa quy trình chiết ADN từ mẫu và lựa
13

chọn các thông số kĩ thuật thích hợp cho phản ứng cũng được thực hiện. Các ADN
thu trong nghiên cứu được làm sạch khỏi các chất chuyển hóa thứ cấp bằng phương
pháp CTAB cải tiến của Khan và cộng sự [37]. Áp dụng phương pháp chiết tách
này cho thấy ADN thu được có độ tinh sạch và chất lượng cao, tỉ lệ hấp thụ
A260/A280 là 1,8 – 2,0 [39]. Tiếp đó là quá trình chuẩn hóa điều kiện của phản
ứng. Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ MgCl
2
khác nhau 0,5mM, 1mM,
1,5mM đồng thời giữ nguyên các thông số khác. Nồng độ MgCl
2
1,5mM được xác
định là tối ưu nhất đã được sử dụng trong phản ứng khuếch đại. Ban đầu phản ứng
khuếch đại được thử với nồng độ enzym là 0,9 đơn vị Taq polymerase nhưng quá
trình thực hiện không cho kết quả tốt. Do đó, lượng enzym này được giảm xuống

Một ví dụ sử dụng kĩ thuật DALP để nhận diện cây thuốc là ở loài Panax
ginseng. Sâm là một loại dược liệu quý nên sự giả mạo thường xuyên xảy ra. Rất
nhiều nghiên cứu với nhiều kĩ thuật khác nhau đã được khai thác nhằm phân biệt
các loài Panax. Ngoài RAPD, kĩ thuật DALP cũng đã được khai thác trong nhận
diện Panax ginseng và Panax quinquefolius. Trong nghiên cứu sử dụng DALP,
phản ứng khuếch đại được thực hiện với mồi xuôi là (5’-GTT TTC CCA GTC ACG
ACG C-3’) và mồi ngược là (5’-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3’). Một trong hai
mồi được đánh dấu bằng ATP-P
33
. Kết quả thu được cho thấy một đoạn đặc hiệu
636 bp chỉ xuất hiện ở mẫu Panax ginseng nhưng không xuất hiện tại mẫu Panax
quinquefolius [25].
Như vậy sử dụng DALP có thể giúp phân biệt được hai loài sâm với nhau.
Cũng như các kĩ thuật RP-PCR, kĩ thuật này có ưu điểm là không yêu cầu bất kì
thông tin nào về bộ gen cần nghiên cứu. Hơn thế nữa, do sử dụng mồi dài hơn cũng
như mức độ chính xác yêu cầu cao hơn, kĩ thuật này cho thấy độ tin cậy cao hơn so
với các kĩ thuật RP-PCR.
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (Amplified fragment
length polyphorphism – AFLP) là kĩ thuật liên quan đến sự khuếch đại toàn bộ các
đoạn ADN giới hạn từ ADN bộ gen sau khi đã được cắt nhờ các enzym giới hạn
[60].
AFLP là sự kết hợp giữa kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn
(Restriction fragment length polymorphism – RFLP) và kĩ thuật PCR. RFLP là một
15

kĩ thuật dựa trên kĩ thuật lai phân tử. Trong RFLP, đoạn ADN được cắt bằng enzym
giới hạn sau đó điện di trên gel agarose. Các băng ADN đa hình được chuyển lên
màng lai và lai với mẫu dò được đánh dấu hóa học. Sự đa dạng được đánh giá bằng
sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng [26].