TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU
BỆNH LÝ CÂY TRỒNG
Trần Văn Dương
1. Mở đầu
Sự phát hiện ra enzym giới hạn (Smith & Wilcox, 1970) và phương pháp
PCR (Mullis & Faloona, 1987) là cơ sở cho các phương pháp chỉ thị phân tử như
RFLP (Botstein et al. 1980 ), microsatellites (Weber & May và Litt & Luty, 1989),
RAPD (Welsh & McClelADN, 1990), AFLPs (Vos et al. 1995), v.v. Các phương này
cho phép xác định các chỉ thị phân tử, lập bản đồ liên kết gen, đánh giá tính đa
hình ADN...(1,2). Tuỳ những nghiên cứu cụ thể mà chỉ thị nào sẽ được lựa chọn
sử dụng. Tuy nhiên, về cơ bản ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị nào trong đánh giá
tính đa hình và lập bản đồ gen.
Ở Việt Nam đã bước đầu ứng dụng thành công các chỉ thị này vào nghiên
cứu gen, nghiên cứu tính đa hình trong sinh giới, tìm chỉ thị liên quan tới mội số
tính trạng …(3,4)
Bệnh ở thực vật do nhiều nguyên nhân. Có thể do côn trùng (sâu xanh, bọ
xít…), nấm (fuccinia arachidis gây bệnh gỉ sắt ở lạc, cà chua), vi khuẩn
(Xanthomonas oryze gây bệnh bạc lá lúa) hoặc virut (bệnh xoan lùn ở bông)… Tuy
nhiên, trong cùng một loài thường có những giống mang gen kháng các bệnh trên.
Chúng chủ yếu là các giống hoang dại, hoặc một số giống địa phương. Đây thực
sự là nguồn nguyên liệu quý để các nhà chọn giống dùng để lai tạo ra các giống
mang gen kháng. Bằng phương pháp chỉ thị phân tử người ta xác định các chỉ thị
ADN liên quan tới gen kháng các bệnh đó. Chỉ thị này có thể liên kết chặt với gen
kháng hoặc có thể chính là gen đó (tuỳ theo từng phương pháp cụ thể). Nhờ có sự
hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống tiết kiệm thời gian chi phí
trong quá trình chọn tạo (5). Chính vì những hữu ích và tiện dụng của chỉ thị phân
tử trên chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên quan
đến bệnh rỉ sắt và héo xanh vi khuẩn ở cây lạc bằng một số kỹ thuật sinh học
phân tử” mong muốn tìm hiểu các chỉ thị phân tử để chẩn đoán bệnh giúp đẩy
nhanh quá trình chọn giống.
2. Tổng quan lài liệu

dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn
ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể.
RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng
cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans.
Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính
trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng
locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật
RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn
trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng
như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây
(Gebarat và cs, 1989) .v.v.
Hiện nay, ở Việt Nam RFLP đã được ứng dụng trong nghiên cứu gen Kappa
casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa (10). Sử dụng RAPD và RFLP
định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Indica (11). Lập bản đồ xác định vị trí gen ảnh
hưởng đến tính kháng mặn của lúa (Oryza sativa L)(12)…
Chỉ thị RFLP có vài trò trong nhiều khía cạnh của sinh học phân tử, đặc biệt trong
lĩnh vực lập bản đồ phân tử. Tuy nhiên, việc thực hiện phương pháp này mất
nhiều thời gian, công sức trong thiết kế mẩu dò. Chi phí đắt, cho nên những chỉ thị
tiện ích hơn lần lượt ra đời.
2.2.Chỉ thị RAPD (Random Aplified Polymorphic ADN)
2.2.1Nguyên lý
Kỹ thuật RAPD là loại chỉ thị dựa trên nguyên tắc PCR sử dụng các đoạn
mồi ngẫu nhiên. Mồi thường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp theo một
trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide trong
genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/4
10
≈ 1/10
10
= 1/1.000.000. Có nghĩa cứ
khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10 gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi

phương pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0 %. Do sự phát hiện tính
đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này được sử dụng cho việc nghiên cứu tính thuần
của giống.
Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một phương
pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di
truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết
và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền trong các kiểu gen lúa
nước và lúa nương, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và Japonica, xác định sự
đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào
trần.
Ưu điểm của kỹ thuật RAPD đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại
tính đa hình cao. Phương pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên, RAPD
cũng có những nhược điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó
phân tích, dẩn đến khi phân tích kết quả rất dể sai lầm do cách đánh giá khách
quan của từng người. Nhưng vì nó dể tiến hành nên phương pháp này hiện nay
rất được ứng dụng ở những nước có điều kiện như nước ta. Hiện nay, phương
pháp RAPD được ứng dụng trong nước ta trong nhiều lĩnh vực: như đánh giá tính
đa hình ở lúa, đậu tương, lạc chè, cà phê, bông, vải, nhạn… định vị gen kháng rầy
nâu ở lúa (4)
2.2.Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats)
2.3.1Nguyên lý
SSR hay còn gọi là Microsatellites, nó thường là những đoạn ADN ngắn có
trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide như CACACACA, và chúng có khuynh
hướng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dị nhiễm sắc như: tâm động
hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vị SSR (như CA) có thể được lặp
lại bốn lần, một số đơn vị khác lại được lặp lại từ hai đến ba mươi lần.
Vùng Microsatellites thường là những vùng siêu biến, nó không chỉ khác
nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi. Đó chính là cơ sở
tạo ra tính đa hình của phương pháp SSR. Tính đa hình SSR thường biểu lộ tính
trội (13).