Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––
NGUYỄN THỊ THU NGÀ
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN
NAC2
LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC
(
Arachis hypogaea
L.)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN
NAC2
LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC
(
Arachis hypogaea
L.)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH
hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố
phiên mãNAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ, thuốc
lá, [54], [55],[60], [77], [87], [103], [127], [133].Trên đối tượng cây lạc,các gen
AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách dòng thành
công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc gen chịu hạn
và chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72].
Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Ở nước
ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác
nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu
hạn kém [13].Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống
hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15].Tuy
nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng
chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều.Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn
ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ thị và
tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn
giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc
và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt.
(2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã
NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá.
(3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng kỹ
thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn của cây lạc.
ii) Cung cấp thông tin về nhân tố phiên mã NAC và gen NAC2 ở cây lạc. Khả
năng chịu hạn ở các giống lạc nghiên cứu và vai trò của gen NAC2 trong đáp ứng
với sự thiếu nước từ môi trường.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây lạc ở mức độ mô sẹo và cây non
được sử dụng làm cơ sở để đánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng chịu
hạn của cây lạc. Kết quả thu được ban đầu về cây lạc chuyển gen sẽ làm căn cứ để
đánh giá ở các mức độ tiếp theo nhằm phục vụ các nghiên cứu về cải thiện tính chịu
hạn của cây lạc. 6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT
1.1.1. Tác động của hạn đến thực vật và cây lạc
1.1.1.1. Cây lạc
Cây lạc có nguồn gốc ở vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ.
Người Bồ Đào Nha đưa cây lạc từ Brazin sang Tây Phi và sau đó đến Tây Nam Ấn
Độ từ thế kỉ XVI. Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới. Ở Việt
Nam, cây lạc được du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ
C - 33
0
C. Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 12
0
C, từ 15
0
C hạt lạc đã
bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 17
0
C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%,
độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở
độ ẩm đất 40% - 50%. Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất
nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu
cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh
trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13].
Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về
các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp.
Diện tích trồng lạctập trung nhiều nhất ở vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh
rồi tới đồng bằng và trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định,
Ninh Bình). Trên thực tế, diện tích trồng lạc ở nước ta còn nhỏ và phân tán, trừ một
vài vùng lạc tập trung như Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá). Gần đây
cây lạc được khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt ở những nơi đất bạc màu, thoái
hoá như vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ, những dải đất ven biển từ Thanh Hoá
chạy dài tới giáp Đông Nam Bộ,… đều có thể trồng được lạc. Nhiều vùng đất, nhất
là ở miền Nam có thể trồng được 2 vụ lạc trong năm [13].
1.1.1.2. Tác động của hạn đến thực vật
Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm đến
nhiều nhất hiện nay. Hiện tượng khô hạn xảy ra khi trong môi trường đất và không
khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy
nước vào tế bào. Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn,
nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm.
Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu
đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng
ruộng. Một trong những phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu
nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này.
[5].Khi gặp hạn, cây lạc cũng chịu ảnh hưởng nặng nề đến quá trình sinh trưởng và
phát triển. Khi tiến hành nghiên cứu ngoài tự nhiên bằng phương pháp gây hạn nhân
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tạo, nhận thấy sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm
giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả
chắc, giảm hàm lượng lipid trong hạt lạc [8].Những quan sát cho thấy, trong điều
kiện thí nghiệm gây thiếu nước ở thời kì ra hoa đã làm giảm nghiêm trọng số hoa,
đợt ra hoa hoặc hoa nở rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa
có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở [13].
Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động của
hạn ở một số giai đoạn phát triển của các đối tượng thực vật khác nhau như mô sẹo,
hạt nảy mầm, cây non 3 lá…Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu
nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in
vitro như ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],…
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng PEG, sorbitol, manitol… như những tác nhân
gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động của hạn lên thực
vật. PEG là một hợp chất có ái lực rất lớn với nước, khi đưa vào môi trường nuôi
cấy, nó không chỉ ngăn cản rễ hút nước mà còn chiếm nước từ rễ cây, khiến cây
nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67].
Như vậy có thể thấy, mức độ ảnh hướng của các yếu tố cực đoan, trong đó có
hạn đến khả năng phản ứng của cây trồng là rất rõ rệt. Hiện tượng mất nước cục bộ
chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán kéo dài sẽ gây thiệt hại cho
trưởng và năng suất của cây lạc[39].Thiếu hụt về độ ẩmlàm cản trở quá trình hình
thành nốt sần ở các cây họ đậu. Có nhiều bằng chứng cho thấy,quá trình hấp thụ N,
P và K của cây lạc bị giảm do hạn hán[39].
Hạnđãảnh hưởngxấu đến cácmối quanhệ vềnước, quang hợp, dinh dưỡng
khoáng, sự trao đổi chấtvà tăng trưởng ở lạc.Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm
giảm hàm lượng chất diệp lục a, b và diệp lục tổng số. Sự sụt giảm chất diệp lục là
do sự ức chế tổng hợp chất diệp lục.Tích lũy hàm lượng chất khô bị giảm khi tình
trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92]. Căng thẳng về nướcthườngxuyêndẫn
đếnthay đổivề giải phẫu họcnhưgiảmkích thướccủa các tế bàovà các khoảng
gianbào, vách tế bào dày hơn vàphát triển hơncủamôbiểu bì, giảm kích thước lá và
thay đổi trong hệ rễ[40], [92].
Sự thoát ra củacác chất hòa tanlàkết quả củahiện tượng tổn thươngmàng tế
bào. Đây là một phản ứngthông thườngcủamôcây lạcdưới ảnh hưởng của một số
điều kiện bất lợi từ môi trường như nhiệt độthấphoặc cao, độ ẩm của đấtthấp hoặcđộ
mặn của đấtcao. Nhiều nghiên cứu đãchỉ ra rằng,canxilà yếu tố cần thiếtđể duy
11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trìtính toàn vẹncủa màng. Quá trình bổ sungcanxicó ảnh hưởngthuận lợiđến
mốiquan hệvề nướccủa cây trồng vàkhả năng chịukhô hạntrongcây lạc[39],
[92].Thiếu nướctrong đất ởgiai đoạn hình thànhvỏ quả có thểlàm giảmsự hấp
thucanxi cho phát triển vỏ vàgây rahiện tượng vỏkhông dày, hàm lượng
canxithấptrong vỏvàhạt.Dấu hiệu điển hìnhcủa sự thiếu hụtcanxitronghạt bao
gồmtimrỗng,hư hỏng phôihoặcphát triểnchồi mầm.
Hầu nhưtất cả cácquá trìnhtrao đổi chất đềubị ảnh hưởng bởisự
thiếunước.Hoạt độngcủa các enzymebị suy giảm do hiện tượng thiếu hụtnước
nghiêm trọnggây ra.Phức hệ carbohydrate vàproteinbị phá hủybởi các enzymethành
các loại đườngđơn giảnvà các amino acid tương ứng.Proline, một aminoacid, được
tích lũy mỗi khi thực vật gặp điều kiện bất lợi về độẩm. Hàm lượng proline được
Cây lạc có thể gặp điều kiện bất lợi về nước trong suốt quá trình đâm tia và
phát triển quả[79]. Điều này sẽ dẫn đến làm giảm rõ rệt về năng suất, mức độ giảm
phụ thuộc vào từng giống lạc.Không chỉ năng suất lạcmà chất lượng của hạtcũng bị
giảm dưới điều kiện hạn hán. Tia không có khả năng thâm nhập hiệu quả vào trong
đất khô. Quá trình đâm tia và vùng rễ trong khu vực đất thiếu nước làm giảm tốc độ
tăng trưởng của quả và hạt giống xấp xỉ 30% và giảm trọng lượng cho mỗi hạt từ
563 đến 428 mg[39]. Hạntronggiai đoạnhình thành quảvà hạtlàm giảm năng suất56-
85% [84], [104].Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ
chất khô tích luỹ cũng cao nên cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác
trong thời kì sinh trưởng. Độ ẩm đất có thể giảm đi trong thời kì quả chín (65% -
70%). Độ ẩm quá cao trong thời kì này (trên 90%) thường dẫn đến lốp đổ và dễ làm
quả bị thối, nảy mầm [7], [79].
1.1.2. Cơ chế chịu hạn của thực vật
Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào đặc
tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Tính chống chịu là khả
năng của thực vật có thể ngăn ngừa được thương tổn khi bị tác động bất lợi từ ngoại
cảnh. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính, làm tăng nhiệt độ cơ thể của cây
và gây mất nước trong cây. Tính chịu hạn là khả năng của cây chịu đựng sự đốt
nóng và khô [7].
Cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, không chỉ liên quan đến đặc
điểm hình thái giải phẫu mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh
trong tế bào, sự điều chỉnh hoạt động của gen liên quan đến tính chịu hạn của thực
vật. Những thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước làm cho chúng bị mất cân
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bằng về thẩm thấu và các cơ chế bảo vệ của thực vật được khởi động để phản ứng
với tình trạng thiếu nước cực đoan [45].
1.1.2.1. Cơ chế biến đổi hình thái của đặc tính chịu hạn
sinh trưởng của lá khi thiếu nước làm giảm nhu cầu nước. Giảm diện tích lá được
coi là một yếu tố quan trọng trong khả năng chịu hạn của cây trồng [45].
Trên phương diện hình thái thì chồi và rễ bị tác độngnhiều nhất bởi tình trạng
thiếu nước. Đây đều là những bộ phận quan trọng của thực vật trong sự thích nghi
với hạn hán. T ái lá có lông là một đặc điểm chịu khô hạn giúp bảo vệ lá khi
nhiệt độ quá cao. Lông lá làm giảm nhiệt độ và thoát hơi nước.Hình thành lớp cutin
và sáp trên bề mặt cũng là một trong những phương pháp hiệu quả về mặt kiểu hình
nhằm chống mất nước [45].
Như vậy, thực vật có thể thoát khỏi hạn hán bằng cách rút ngắn thời gian
sinh trưởng, và tránh hạn với việc duy trì tiềm năng nước trong mô bằng cách giảm
sự mất nước,tăng cường sự hấp thu nước, hoặc cả hai. Một số thực vật có thể làm
giảm diện tích bề mặt của chúng bằng cách rụng lá hoặc tạo lá nhỏ.
1.1.2.2. Cơ chế sinh lý, hóa sinhcủa đặc tính chịu hạn
Điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT), bảo vệ thẩm thấu, các chất chống oxy
hóa cóvai trò vô cùng quan trọng hình thành nên một hệ thống bảo vệ có ảnh hưởng
đếnkhả năng chịu hạn của thực vật[45], [73].
Cơ chế hóa sinh có tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện mất nước là: khử
độc các sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử, xúc
tiến sự phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại. Sau khi hạn ngừng tác động, quá
trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ gen được bảo tồn khỏi hư hại trong thời gian
khô hạn. Điều đó có được là do các protein trong nhân với sự tham gia của các
protein đáp ứng với stress đặc hiệu, nhờ vậy mà DNA chỉ bị biến đổi khi hạn nặng
kéo dài. Khi gặp hạn, trong tế bào xuất hiện nhiều H
2
O
2
gây độc cho tế bào và cho
cây, vì vậy trong cây có hiện tượng tăng hoạt tính các enzyme oxydoreductase để
giải độc. Đây cũng là một cơ chế để bảo vệ ti thể khỏi bị tổn thương.
phục hồi từ thời điểm thiếu nước, điều này đóng một vai trò quan trọng trong việc
bảo vệ các bộ phận của tế bào khỏi bị hư hại bởi các phản ứng oxy hóa. Thiệt hại do
oxy hóa trong các mô thực vật được giảm bớt bởi sự phối hợp hoạt động của một hệ
thống các chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme. Chúng bao gồm β-carotene,
acid ascorbic,α-tocopherol, glutathione khử[45]. Sự hình thành carotenenhư một
phần quan trọng của hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ở thực vật [119]. β-carotene
trong lục lạp của tất cả các cây xanh liên quan chặt chẽvới hệ thống trung tâm
quang hệ I và quang hệ II. Ở đây, β-carotene, ngoài chức năng như một sắc tố còn
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hoạt động như một chất chống oxy hóa hiệu quảvà đóng một vai trò duy nhất trong
việc bảo vệ chu trình quang hóa [45].
c) Ổn định màng tế bào
Màng sinh học là mục tiêu tác động đầu tiên của nhiều nhân tố phi sinh học
bất lợi. Việc duy trì tính toàn vẹn và sự ổn định của màng dưới điều kiện thiếu nước
là một cơ chế chính trong khả năng chịu hạn ở thực vật. Khả năng chịu hạnđược
xem như tăng sự ổn định màng tế bào trong điều kiện thiếu nước[45].
Các nguyên nhân của sự phá vỡ màng chưa được biết, tuy nhiên, giảm bớt về
thể tích tế bào gây ra hiện tượng tăng độ nhớt của các thành phần tế bào chất. Điều
này làm tăng khả năng tương tác phân tử dẫn đến có thể gây ra biến tính protein.
Một loạt các hợp chấtđược xác định có thể ngăn chặn các phân tử tương tác bất lợi
trong điều kiện hạn. Có thể kể đến là proline, glutamate, glycinebetaine, sorbitol,
fructans,sucrose và oligosaccharides. Khả năng thoát ion ra khỏi tế bào có thể là do
hiện tượng ức chế bởi nhiệt của các enzyme chịu trách nhiệm giới hạn màng để duy
trì gradient hóa học trong tế bào [75].
d) Điều hòa sự phát triển của thực vật
Điều hòa sự phát triển của thực vật liên quan đến các phytohormon được sản
xuất trong tế bào. Những chất có ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý trong cơ thể
động của các yếu tố bất lợi.Sự quan tâm trong các nghiên cứu ngày càng tăng về sự
tham gia của polyamine trong phản ứng bảo vệ cơ thể thực vật chống lại các yếu tố
bất lợitừ môi trường [45]. Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình
trao đổi chất polyamine được tách dòng từ một số loài, và biểu hiện của chúng dưới
một số điều kiện bất lợi đã được phân tích[129].
e) Các chất hoà tan và điều chỉnh thẩm thấu
Một trong những khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phổ biến nhất trong
thực vật là sản xuất lượng lớn các loại chất hữu cơ hoà tan khác nhau. Chúng bảo vệ
cơ thể thực vật khi gặp các yếu tố bất lợi thông qua các biện pháp như điều chỉnh
thẩm thấu, khử độc bởi các phản ứng oxy hóa, ổn định màng tế bào và cấu trúc tự
nhiêncủa enzyme, protein. Điều chỉnh thẩm thấu là một cơ chế để duy trì mối quan
hệ về nước dưới sự bất lợi về thẩm thấu. Nó liên quan đến sự tích tụ của một loạt
các phân tử/ion, bao gồm đường tan, proline, glycinebetaine, axit hữu cơ, canxi,
kali, ion clo…[7]
Quá trình điều chỉnh thẩm thấu được thực hiện với sự tích lũy các chất hòa
tan. Trong số này, prolinelà một trong những chất quan trọng nhất và sự tích lũy
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
proline tự do là một đáp ứng phổ biến của thực vật bậc cao, tảo, động vật và vi
khuẩn khi tiềm năng nước thấp [119]. Vai trò sinh lý của proline tự do bao gồm bảo
vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về
ASTT, bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme
khác nhau, chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và bất hoạt
các gốc oxy tự do [108].
Glycinebetaine (N, N, N-trimethyl glycine) là một trong những hợp chất hoà
tan được nghiên cứu nhiều trong thực vật, động vật và vi khuẩn [119]. Nhiều
nghiêncứu chứng minh rằng, glycinebetaine đóng một vai trò quan trọng trong việc
tăng cường khả năng chống chịu của thực vật dưới tác động của các yếu tố bất lợi
lạnh (antifreeze proteins), protein gắn với mRNA (mRNA binding protein), enzyme
chủ chốt trong sinh tổng hợp các chất điều hoà áp suất thẩm thấu và các loại
protease khác nhau (hình 1.1) [101].
Hình 1.1. Chức năng của các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn [101]
Để biểu hiện bất kỳ gen nào cũng đều cần có sự hoạt hóa promoter của chúng.
Hệ thống tín hiệu nhận biết từng loại stress khác nhau, bao gồm nhiều chất cảm ứng
có nguồn gốc protein hoặc là các chất khác. Đó là các yếu tố điều hòa phiên mã như
MYB, MYC, NAC, DREB, protein kinase như MAP kinase Các protein có chức
năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối
20
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
với tình trạng hạn như protein kinase, TF và các enzyme trong chuyển hoá
phospholipid.
Protein chức năng như aquaporins có khả năng tạo điều kiện thuận lợi và
điều chỉnh trao đổi nướcthụ động qua màng. Chúng là thành viênthuộc một họ
protein bảo thủ cao trong màng tế bào. Ở thực vật, aquaporins có mặt nhiều trong
màng sinh chất và trong màng không bào. Phân tích cấu trúc của aquaporins đã cho
thấy cơ chế chung của protein vận chuyển nước qua màng. Aquaporins có thể điều
chỉnh tính thấm của màng tế bào theo cả hai hướng phụ thuộc vào ASTT[7].
Aquaporins giữmột vai tròđặc biệt trong việc kiểm soát vận chuyển nướcqua màng.
Protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein)có chức năng môi giới phân tử
được gọi là chaperone. Chúng có một vai trò quan trọng việc tái tạo lại cấu trúc
không gian đúng của protein mới tổng hợp, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein,
ngăn chặn sự hủy hoại của protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu cho sự phân
giải protein bị biến tính. Protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử thấp thường được
sản xuất để đáp ứng với các yếu tố bất lợi của môi trường [7], [119].HSP chiếm trên
1% protein tổng số trong lá, rất đa dạng và có ở hầu hết các loài thực vật. Chúng
gây thiệt hại [23], [28].
Biểu hiện gen có thể đượckích hoạt trực tiếp dưới tác động của các yếu tố bất
lợi hoặc là kết quả của các đáp ứng thứ cấp khi bị thương tổn. Tuy nhiên khả năng
chống chịu hạnlà một hiện tượng phức tạpliên quan đến hoạt động của nhiều gen
[7]. Khi gặp hạn, một loạt các cơ chế bảo vệ được khởi động thông qua việc tiếp
nhận các tín hiệu được cơ thể thực vật nhận biết. Khi đó, những thay đổi trong biểu
hiện gen (điều chỉnh lên và xuống) sẽ diễn ra. Những gen khác nhau được cảm ứng
để đốiphó với hạn hán ở mức độ phiên mã, các sản phẩm của gen được cho là có
chức năng trong chống chịu hạn [101].
Có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng
đối với điều kiện sinh thái phi sinh học bất lợi. Xu hướng thứ nhất là tìm những gen
liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu hạn, lạnh, ngập úng hay phèn
mặn…(Ví dụ RD29A), xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo
hướng các yếu tố điều khiển như các nhân tố phiên mã [1].
Các yếu tố cực đoan của môi trường trong đó có hạn tác động lên các nhân tố
phiên mã (ví dụ CBF1 – hình 1.2), tiếp theo, nhân tố phiên mã hoạt hóa khả năng
phát hiện và gắn với DNA nhờ các yếu tố cis phản ứng với sự mất nước (DRE –
22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
drought responsive element) trên promoter của gen đích (ví dụ RD29A – hình
1.2)tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều
kiện môi trường đến việc hoạt hóa các nhân tố phiên mã và tham gia vào quá trình
điều hòa biểu hiện gen đích ở giai đoạn phiên mã. Trong quá trình này, có thể đồng
thời tham gia nhiều gen, tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên
mã cũng như protein liên quan đến tính chống chịu.
Hình 1.2. Mô hình hoạt động của gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn [76]
Việc tìm kiếm gen liên quan đến khả năng chịu hạn theo xu hướng thứ nhất
gặp hạn hoặc bị mất nước, chúng đều được tổng hợp với lượng đáng kể ở
Arabidopsis. Gen mã hóa cho protein DHN13 của đại mạch có trong hầu hết các mô
tế bào ở điều kiện bình thường cũng như khi gặp hạn, lạnh và xử lý ABA, còn
protein DHN4 chỉ có trong hạt, khi xử lý ABA và mất nước. Các gen dehydrin khác
của đại mạch như Dhn1, Dhn 3, Dhn 4, Dhn 6, Dhn 9 đều có sản phẩm phiên mã rõ
rệt khi mất nước và xử lý ABA [7], [94].
Nhiều gen mã hóa cho enzyme tham gia vào các phản ứng với hạn đã được
nghiên cứu về mặt chức năng. Các độc tố xuất hiện dưới ảnh hưởng của các yếu tố
bất lợithường do nguyên nhân có sự tích lũy các phân tử phản ứng lại với các yếu tố
bất lợi như aldehyde. Các phân tử này có thể là nguyên nhân phân giải lipid, làm
biến đổi các protein và acid nucleic. Dưới tác động của aldehyde dehydrogenase
(ALDH), aldehyde có thể bị biến đổi thành carboxylic acid không độc. Gen mã hóa
cho ALDH xuất hiện trong tất cả các cơ thể sinh vật cho thấy sự quan trọng của nó
trong các chức năng sinh học nói chung. Sự cân bằng aldehyde là rất cần thiết trong
24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
quá trình bảo vệ thẩm thấu khỏi các yếu tố bất lợi. Gen BADH (betaine aldehyde
dehydrogenase) cũng đóng vai trò quan trọng trong sự chống chịu của thực vật với
hạn và muối. Gen JcBD1 thuộc nhóm này đã được biểu hiện, sau khi đánh giá cho
thấy khả năng chịu hạn cao hơn so với đối chứng [131]. Trong các chất tan, proline
được xem là chất đóng vai trò chính trong điều chỉnh thẩm thấu ở các cây chịu khô
hạn hoặc đất nhiễm mặn. Vai trò của các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác cho
quá trình tổng hợp proline liên quan tới khả năng chịu hạn của thực vật nói chung
và cây trồng nói riêng đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến [42]. Hầu hết các
amino acid tăng lên khi cảm ứng với điều kiện bất lợi của môi trường nhưng proline
tăng lên rõ rệt hơn cả. Khi tế bào bị mất nước nghiêm trọng hàm lượng proline tăng
lên 48 lần so với đối chứng. Khi xử lý với muối, cây tích lũy proline một cách từ từ
và tăng gấp 7 lần so với đối chứng sau 72 giờ xử lý [112].
1.2.1. Nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật
Sự phản ứng của cơ thể thực vật ở các mức độ khác nhau trước tác động của
các yếu tố cực đoan đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu hiện nay. Sự phản
ứng đầu tiên của tế bào khi mất nước là xuất hiện ABA. Trong trường hợp này các
gen đặc hiệu được biểu hiện, một loạt các chất được tổng hợp mới trong tế bào
Những yếu tố cực đoan khác nhau (hạn, mặn, lạnh) tạo ra những tín hiệu như nhau
và sự phản ứng của cơ thể sống đối với các yếu tố cực đoan của ngoại cảnh phụ
thuộc vào từng loài, kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi
và giai đoạn của sự phát triển, dạng các cơ quan hoặc tế bào [7], [101].
Copyright: Tài liệu đại học ©