BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
LÒ THANH SƠN
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN
GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ
CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015

Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện
đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái

2. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh
Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và
chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp
chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52.
3. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh
Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen
GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ một số giống đậu
tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị
Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196.
4. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu
Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến
sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai mẫu đậu tương địa
phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ
Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134.
Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế
Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005,
HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010,
LN681352, LN681353.
Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916.

- 1 -

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều
quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì. Đậu tương rất có
giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế. Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều
amino acid không thay thế và các vitamin cần thiết cho cơ thể người và động
vật. Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi

triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp
hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương.
Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem
là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay.
Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã
được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính,
đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công
nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống
đậu tương có khả năng chịu hạn cao.
Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc
điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu
tương (Glycine max (L.) Merrill)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự
kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về
trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số
giống đậu tương địa phương.
(ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên
quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương.
(iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1
biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen.
(iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên
quan đến sự phát triển kéo dài rễ.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông
qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân
nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ.

bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84. Cơ sở khoa học và hiệu
quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây
trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển
gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển
gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng.
Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên
cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương
ở Việt Nam.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong
nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư
liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.

- 4 -

Về mặt thực tiễn
Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so
với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng
kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và
những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự
phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết
quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải
thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong
thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được
chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài

hoá bởi đa họ gen (multi-gene family) được phát hiện ở nhiều thực vật như
lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây Riêng ở cây đậu tương có tới 75
gen EXP khác nhau nằm trên 18 cặp NST tương đồng, trong đó gen GmEXP1
thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm 3 exon và 2 intron xen k. Trình
tự mã hoá của gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255
amino acid (Kende và cs, 2004; Zhu và cs, 2014). Protein tương ứng gồm 3
vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức năng DPBB xúc tác dạng enzyme
endoglucanase và vùng Pollen allerg bám dính cơ chất (Wu và cs, 2001). Khi
thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 và tỷ lệ khối lượng expansin với
thành tế bào đạt 1 : 10.000 thì expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế
bào bằng cách len lỏi, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các thành phần
polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng
lưới polymer. Áp lực sức trương của tế bào làm khoảng cách giữa các vi sợi mở
rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc (Cosgrove và cs 2000, 2005).

Hình 1.4. Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin (theo Cosgrove - 2000)
A: Expansin bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ
gãy các liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng
trượt và đẩy giãn khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào.
Ngoài ra tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin còn gây hiệu quả gián
tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với cơ chất, đẩy nhanh hiệu quả
tăng kích thước tế bào. Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động và phân bố
của expansin trong tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng của rễ đậu tương cho thấy

- 6 -

vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật
hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu (Cosgrove và cs 1998).
Những tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen thực vật nhờ A. tumefaciens mở
ra khả năng tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến sự phát triển kéo


- 7 -

chuyển gen và phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm
trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Công trình được hoàn thành tại Bộ môn
Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chia thành 6 nhóm chính: (1)
nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ, (2) nhóm phương
pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp phát
triển vector chuyển gen GmEXP1, (4) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen,
(5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen và (6) phân tích, xử lý số liệu.
2.3.1. Nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ
Các giống đậu tương, các dòng thuốc lá nghiên cứu được gây hạn trên hệ
thống thí nghiệm gây hạn nhân tạo (thực hiện theo Lê Trần Bình và cộng sự -
1998) sau khi nảy mầm và đạt 3 lá thật. Mỗi giống/dòng đều được bố trí song
song 3 lô thí nghiệm (lặp lại 3 lần) và một lô đối chứng, mỗi lô 10 cây/1 giai

- 8 -

đoạn gây hạn. Khi các cây có 3 - 4 lá thật thì bắt đầu ngừng cung cấp nước để
gây hạn nhân tạo. Xác định các chỉ số liên quan đến sự phát triển bộ rễ qua


- 9 -

cộng sự - 2006 và tham khảo quy trình tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen
của Nguyễn Thị Thuý Hường - 2011 và Nguyễn Thị Thu Hiền 2014.
2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu SoyExp1F_NcoI/Soy Exp1R_NotI. Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm
phiên mã gen GmEXP1 bằng RT-PCR. Đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã
của gen chuyển bằng Real-time RT-PCR theo phương pháp R=2
-∆∆Ct
của
Livak - 2001. Kiểm tra sự có mặt của protein expansin ngoại lai bằng Western
blot. Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển bằng cách đặt
cây chuyển gen trong môi trường gây hạn nhân tạo và đánh giá qua so sánh các
chỉ tiêu phát triển bộ rễ (chiều dài rễ chính, thể tích, khối lượng khô bộ rễ).
2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu
Hiệu suất chuyển gen (%) =
Số cây mang gen chuyển
Tổng số mẫu biến nạp
× 100
Kết quả nghiên cứu về các trình tự gen, amino acid được xử lý bằng phần
mềm BioEdit, DNA Star; Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm
Excel và NTSYS PC2.1 (Chu Hoàng Mậu 2008).

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
NGHIÊN CU
Đánh giá sự phát triển bộ rễ qua các giai đoạn gây hạn nhân tạo để phân

3.2. ĐC ĐIỂM GEN GmEXP1 PHÂN LẬP T MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
3.2.1. Đặc điểm gen GmEXP1 phân lập t cDNA của một s ging đậu tương
3.2.1.1. Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen GmEXP1
Cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI được thiết kế dựa trên trình tự
gen GmEXP1 của đậu tương AF516879 đã công bố tại Ngân hàng gen quốc tế
để nhân bản và phân lập gen GmEXP1 từ các mẫu nghiên cứu; đồng thời
mang trình tự chứa điểm cắt giới hạn của enzyme NcoI/NotI phục vụ phát
triển vector. Sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA được kiểm tra
trên gel agarose nhận được một băng DNA kích thước khoảng 0,79kb phù hợp
với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2-A). Gen GmEXP1
được tách dòng với các bước: gắn vào vector pBT; biến nạp vào E.coli DH5α
bằng sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích tái tổ hợp bằng cặp mồi
pUC18_F/pUC18_R (Hình 3.2-B). Trước khi đọc trình tự, plasmid tái tổ hợp
gen GmEXP1 được cắt kiểm tra bằng BamHI cho kết quả dương tính 7/7 mẫu
thử. Việc giải trình tự trên máy tự động được thực hiện lặp lại 3 lần/mẫu.

- 11 -
A
B
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1 và colony-PCR
chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
1 - 6: các giống đậu tương Sơn La; 7: giống DT84; 15 - 28: sản phẩm colony-PCR từ một số
dòng khuẩn lạc bằng cặp mồi pUC18; (+): đối chứng dương PCR từ cDNA_GmEXP1 với
cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; M: thang chuẩn DNA 1kb

Kết quả phân tích cho thấy, gen GmEXP1 phân lập được từ cDNA các
giống đậu tương nghiên cứu có kích thước 768 bp và tương đồng với trình tự

Hình 3.5. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyn v trình tự nucleotide đoạn mã hoá của
gen EXP1 ở một s loài thực vật
Tỷ lệ tương đồng đoạn mã hoá gen EXP1 của các giống đậu tương nghiên
cứu và các loại thực vật khác dao động trong khoảng 45,1 đến 92,6%, trong
đó, gần nhất là đậu cove XM_007160571 (tương đồng 92,4 - 92,6%); xa nhất
là lê dại KC855735 (tương đồng 45,1 - 45,2%). Các đối tượng thực vật nghiên
cứu phân thành 2 nhóm chính, nhóm I gồm 12 trình tự và nhóm II có 5 trình
tự; khoảng cách di truyền giữa hai nhóm là 49,7%.
3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN GmEXP1
3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1
Cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 gồm các thành phần: CaMV35S khởi
động phiên mã gen GmEXP1 ở tất cả các mô bào thực vật; trình tự xác định
chuỗi c-myc kháng nguyên phục vụ phản ứng Western blot; và polyA ổn định
cấu trúc mRNA. A
B
C

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI
và sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
M: thang chuẩn DNA 1kb; SP1: Gen GmEXP1 đã tinh sạch sau khi cắt pBT_GmEXP1 bằng
NcoI/NotI; SP2: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI
1-3: các dòng khuẩn lạc; (-): PCR E.coli không biến nạp; (+): PCR gen GmEXP1

- 13 -

Tạo cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1được tiến hành theo các bước: i)
Thu nhận gen đích GmEXP1 từ vector pBT_GmEXP1 bằng cặp enzyme giới

- 14 -

A
B
C
D
E
F
Hình 3.10. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuc lá chuyển gen
A. Mảnh lá trên môi trường đồng nuôi cấy; B. Tái sinh đa chồi;
C. Chọn lọc ở giai đoạn kéo dài chồi; D: Ra rễ; E: Cây ra bầu trấu cát; F: Cây ra nhà lưới
Kết quả (bảng 3.6) cho thấy, với 60 mảnh lá K326 biến nạp tạo được 175
cây in vitro sống sót trên môi trường MS có kháng sinh kanamycin 50 mg/l và
cefotaxim 400 mg/l; lựa chọn 44 cây chuyển gen (từ lô thí nghiệm) và 15 cây
không chuyển gen (từ lô ĐC1) sinh trưởng tốt đưa ra nhà lưới.
Bảng 3.6. Thng kê s lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuc lá N. tabacum
Công
thức
S mẫu
biến nạp
S mẫu sng sót
tạo cụm chồi
S cây sng
sót ra rễ

Ghi chú: * ĐC0 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung
kháng sinh; * ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ
sung kháng sinh.
3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuc lá ở
thế hệ T
0

Xác định sự có mặt của gen GmEXP1 trong hệ gen cây thuốc lá T
0

Thu mẫu lá của 44 cây chuyển gen T
0
, tách DNA và thực hiện PCR với
cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; kết quả kiểm tra sản phẩm PCR
bằng điện di trên gel agarose thu được 32/44 cây có băng DNA kích thước
khoảng 0,79 kb - tương ứng với kích thước gen đích GmEXP1 (hình 3.11).
Hiệu suất chuyển gen giai đoạn này đạt 32/60 = 53,33%. Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xc định sự có mặt của gen
GmEXP1 trong các cây thuc lá chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 44: các cây thuốc lá chuyển gen; wt: cây đối chứng không
chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pCB301_GmEXP1

- 15 -

Xác định sự có mặt sản phẩm phiên mã của gen chuyển trên các cây
thuốc lá chuyển gen T
0
bằng kỹ thuật RT-PCR


- 16 -

Áp dụng phương pháp R=2
-ΔΔCt
của Livak xác định tỷ lệ biểu hiện phiên
mã của gen GmEXP1 khi so sánh với gen tham chiếu Actin qua phản ứng
Real-time RT-PCR, kết quả phản ánh cây 26 và 36 có mức độ biểu hiện gen
chuyển tương đương nhau; cây 30 cao hơn gấp khoảng 2 lần.
Phân tích sự biểu hiện của gen GmEXP1 ở thế hệ T
0
dựa trên sự có mặt
của protein expansin trên cây thuốc lá chuyển gen Hình 3.15. Hình ảnh lai Western (cơ chất TMB) các cây thuc lá chuyển gen T
0

M: thang chuẩn protein; 26 - 36: mẫu protein các cây thuốc lá chuyển gen; (+): protein
37kDa có chuỗi c-myc đầu C; wt: mẫu protein cây thuốc lá không chuyển gen
Kết quả điện di protein tổng số và lai Western (hình 3.15) đều biểu hiện
băng protein ở vị trí kích thước khoảng 30 kDa tương ứng với kích thước tính
toán của protein ngoại lai expansin bằng phần mềm ExPASy Compute pI/Mw.
Như vậy gen chuyển GmEXP1 từ đậu tương đã chuyển thành công vào cây
thuốc lá T
0
, đã biểu hiện phiên mã cho mRNA và dịch mã cho protein
expansin tương ứng.
3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen
chuyển GmEXP1 trên cây thuc lá ở thế hệ T

gen thế hệ T
1
so với mẫu cây chuyển gen T
0
26
Phản ứng Real-time RT-PCR thực hiện với hai cặp mồi xác định gen
chuyển GmEXP1 và gen tham chiếu Actin ở các cây thuộc hai dòng chuyển
gen T
1
26 và T
1
30 thu được các giá trị ngưỡng nhiệt Ct. Phân tích kết quả về
mức độ biểu hiện gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen T
1
bằng t-Test
(với α=0,001) cho thấy, hai dòng T
1
26 và T
1
30 có mức độ biểu hiện phiên mã
là như nhau, đồng đều và ổn định với mức độ tin cậy 99,9%.
Các cây T
1
26-4, T
1
30-3, T
1
30-4 có mức độ biểu hiện gen chuyển cao hơn
cây T
0


Hình 3.19. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) cc đòng thuc lá chuyển gen thế hệ T
1

1 - 4: Các cây chuyển gen dòng số 26; 5 - 8: Các cây chuyển gen dòng số 30; wt: Cây thuốc
lá không chuyển gen làm đối chứng âm; (+): Protein cây chuyển gen T
0
26 làm đối chứng
dương; M: thang chuẩn protein 10 - 180 kDa
Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên
cây thuốc lá ở thế hệ T
1
Sự biểu hiện chức năng sinh học của gen GmEXP1 được đánh giá qua các
đặc điểm phát triển bộ rễ cây T
1
trong điều kiện hạn so với đối chứng. Kết quả
so sánh về thể tích, khối lượng khô bộ rễ và chiều dài rễ chính được trình bày
trong các bảng 3.10, 3.11 và 3.12 của luận án.

Hình 3.20. Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuc lá (A) và so sánh hình thái
rễ có tưới nước và cây không tưới nước (B) ở giai đoạn 5 ngày gây hạn
WT: Cây thuốc lá đối chứng không chuyển gen; 26, 30: Các dòng thuốc lá chuyển gen
Kết quả phân tích cho thấy, thể tích bộ rễ cây chuyển gen so với đối
chứng tăng mạnh trong khoảng 7 ngày đầu gây hạn (29,82 - 41,15%) và sau
đó giảm dần do mất nhiều nước; khối lượng khô bộ rễ cây chuyển gen tăng từ
30,64 đến 39,69% so với cây đối chứng không chuyển gen.
Chiều dài rễ chính qua các giai đoạn gây hạn ở cây không chuyển gen chỉ
tăng từ 1,59 đến 9,82% so với đối chứng trong khi các cây chuyển gen tăng từ
4,85 đến 22,27%. So với cây đối chứng không chuyển gen trong điều kiện
hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T

D: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; E: Tạo rễ RM; F: Cây ra giá thể.
Qua hai lần biến nạp với 380 mảnh lá mầm (Bảng 3.13) thu được 103 mẫu
tạo chồi, 34 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM,
21 chồi ra rễ khoẻ mạnh và thu được 9 cây T
0
phát triển trên giá thể. Lô ĐC1
tạo được 3 cây khoẻ mạnh trên giá thể làm đối chứng.

Bảng 3.13. Thng kê s lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84
Lô thí
nghiệm
S mẫu thí
nghiệm
S mẫu tạo
chồi
S chồi
kéo dài
S chồi
ra rễ
S cây sng
trên giá thể
TN1
180
50
16
9
4
TN2
200
53

- 20 - Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xc định sự có mặt của gen chuyển
GmEXP1 trong cc cây đậu tương chuyển gen
M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 9: sản phẩm PCR các cây chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển
gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA cây đậu tương không chuyển gen.
Điều đó chỉ ra rằng, hệ gen của cây đậu tương chuyển gen số 4 và số 7 (ký
hiệu là cây DT
0
4 và cây DT
0
7) có mặt của gen ngoại lai GmEXP1. Hiệu suất
chuyển gen GmEXP1 ở giai đoạn đánh giá này đạt 2/380 = 0,53%.
3.5.2.2. Phân tích biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 dựa trên sự có mặt
của protein expansin ngoại lai trên cây đậu tương chuyển gen
Điện di protein tổng số từ lá hai cây đậu tương DT
0
4 và DT
0
7 và thực hiện lai
hai loại kháng thể sau khi chuyển lên màng lai nitrocellulose. Kết quả hiện màu
với cơ chất DAB (hình 3.23) cho thấy, cây DT
0
4 xuất hiện băng màu ở vị trí
khoảng 30 kDa tương đương kích thước protein expansin ở đối chứng dương.

Hình 3.23. Kết quả lai Western (cơ chất DAB) các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T
0


- Đậu tương là cây trồng quan trọng và chiến lược của nhiều quốc gia
nhưng thuộc nhóm chịu hạn kém, đòi hỏi áp dụng những tiến bộ khoa học
nhằm cải thiện đặc tính này.
- Chọn tạo giống đậu tương chống chịu tốt với điều kiện khô hạn đã được
tiến hành từ lâu với các biện như pháp lai giống truyền thống, gây tạo đột biến
thực nghiệm đã thu được những thành quả nhất định như: DT2008 (Viện Di
truyền Nông nghiệp); các giống ML48, ML61 (Chu Hoàng Mậu 2001)
- Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen và A.tumefaciens đã được thực
hiện thành công từ 1988 (Hinchee) và ngày càng có nhiều thành tựu về cây đậu
tương chuyển gen; ở Việt Nam cng có một số tác giả thực hiện chuyển gen và
tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen chống chịu sâu hại; chống chịu
hạn; sản xuất vaccin thực vật; kháng bệnh do virus đã minh chứng tiềm năng
của kỹ thuật này trong chọn tạo giống đậu tương cải thiện khả năng chịu hạn.
Lựa chọn gen đích phù hợp nhằm cải tiến bộ rễ - cải thiện khả năng chịu
hạn ở đậu tương
Gen đích được lựa chọn trong đề tài luận án là GmEXP1 cho hiệu quả cải
tiến bộ rễ dẫn đến làm tăng khả năng chịu hạn ở đậu tương vì các lý do:

- 22 -

- Gen chuyển GmEXP1 được lấy từ giống đậu tương có khả năng chịu hạn
tốt, xác định protein expansin cho hiệu quả giãn thành tế bào vùng sinh trưởng
dẫn đến kéo dài rễ, làm tăng khả năng nhận nước của cây đậu tương từ lớp đất
sâu và vùng ngoại vi trong điều kiện khô hạn, cải thiện khả năng chịu hạn.
- Sử dụng gen GmEXP1 từ giống đậu tương chịu hạn tốt chuyển vào
giống đậu tương chịu hạn kém s tránh được những khó khăn trong biểu hiện
chức năng sinh học của protein ngoại lai trong hệ thống biểu hiện mới vì:
+ Expansin hoạt động độc lập, không nằm trong chuỗi phản ứng trao đổi
chất nên không bị giới hạn về cơ chất cng như sự ức chế của sản phẩm xúc tác.
+ Expansin không phải protein điều hoà nên không gặp trở ngại trong biểu