Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1
LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ
CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
Glycine max (L.) Merrill

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai
công bố trong một công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều
ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Hào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thanh Sơn, Trường Đại học Tây
Bắc đã đóng góp những ý kiến quý báu và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong
quá trình tiến hành thí nghiệm để hoàn thành đề tài luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di
truyền&Sinh học hiện đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại
học Thái Nguyên, cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật,

MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả năng chịu hạn 3
1.1.1. Chọn giống đậu tương chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm 4
1.1.2. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng công nghệ tế bào thực vật 5
1.1.3. Chọn dòng đậu tương chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen 6
1.2. Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương 7
1.2.1. Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương 7
1.2.2. Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương 10
1.2.3. Vector chuyển gen ở thực vật 11
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. Vật liệu và thiết bị 14
2.1.1. Vật liệu 14
2.1.2. Hoá chất và thiết bị 15
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2.1. Phân lập gen 16
2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.3. Phương pháp thiết kế vector 25
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
3.1. Phân lập gen GmEXP1 bằng kỹ thuật RT-PCR 27
3.1.1. Nhân bản đoạn mã hoá của gen GmEXP1 27
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmEXP1 27
3.1.3. Kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 33
3.1.4. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 34
3.2.2. Kết quả cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương SL1 14
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 15
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 28
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel đoạn mã hoá của gen GmEXP1 29
Hình 3.3. Ảnh khuẩn lạc 31
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 32
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp 33
Hình 3.6. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước khi đọc trình tự 34
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmEXP1 của giống đậu
tương SL1 và AF516879 36
Hình 3.8. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 giữa giống SL1
và AF516879 37
Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1 38
Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng NotI + NcoI 40
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 bằng HindIII 42
Hình 3.12. Ảnh cắt pCB301 bằng HindIII 43
Hình 3.13. Hình điện di sản phẩm colony- PCR 45
Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR 47
Hình 3.15. Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào cây thuốc lá 49
Hình 3.16. Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ lá cây thuốc lá 50
Hình 3.17. Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá 51


NST Nhiễm sắc thể
OD Optical density Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi
RM Rooting medium - Môi trường ra rễ
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquaticus
v/p vòng / phút
X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng thuộc họ Đậu, là
cây trồng ngắn ngày. Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng và có giá trị kinh tế
cao, với tỉ lệ 30% - 56% protein; 12% - 25% lipid; 36% - 40% hydrat cacbon.
Ngoài ra hạt đậu tương còn chứa các loại amino acid không thay thế như:
cystein, lysine, triptophan, leucine, methyonine. Từ hạt đậu tương người ta có
thể chế biến ra khoảng 600 sản phẩm khác nhau bằng các phương pháp cổ
truyền, thủ công hoặc hiện đại. Do nguồn nguyên liệu trong nước chưa đáp
ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp chế biến, cho nên nước ta vẫn phải
nhập đậu tương từ một số quốc gia trên thế giới.
Mặt khác luân canh cây đậu tương với cây ngũ cốc sẽ có tác dụng phá

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA từ mRNA;
3.2. Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng và xác định trình tự đoạn mã
hoá của gen GmEXP1 phân lập từ cây đậu tương;
3.3. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 và biến nạp vector
chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
3.4. Chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và kiểm
tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Chọn giống đậu tƣơng theo định hƣớng nâng cao khả năng chịu hạn
Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây
mất nước trong cây. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra
trong tế bào. Sự thiếu hụt nước ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và
phát triển của cây, nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu
nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá
trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học
dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết. Nói chung hạn hán ảnh hưởng đến
mọi giai đoạn sinh trưởng của cây, đặc biệt với cây đậu tương thì giai đoạn
tạo hạt đặc biệt cần nước vì giai đoạn này quá trình tổng hợp protein diễn ra
mạnh do đó nước cung cấp cho cây lúc này có ý nghĩa lớn quyết định năng

1,46
002
1,46
1,5
1,52
Tổng sản lượng
cả năm (tấn)
275,5
267,6
213,6
296,9
254,2
300
350
Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo [31] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
1.1.1. Chọn giống đậu tƣơng chịu hạn bằng đột biến thực nghiệm
Dựa vào nguồn tác động mà người ta phân ra thành đột biến tự nhiên
hay đột biến nhân tạo (Kodym và đtg, 2003) [22], dựa vào tính chất biến đổi
cấu trúc của cơ sở vật chất di truyền mà người ta chia đột biến thành đột biến
gen hay đột biến nhiễm sắc thể. Đột biến tự nhiên phát sinh với tần số thấp,
để khắc phục nhược điểm này người ta đã sử dụng các tác nhân gây đột biến
(tác nhân vật lí, hóa học) nhằm làm tăng tần số lên hàng 100.000 lần để tạo
nguyên liệu cho quá trình chọn lọc (Kodym và đtg, 2003) [22]. Nghiên cứu
cải tiến giống cây trồng bằng phương pháp đột biến thực nghiệm ra đời từ
những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng chỉ 30 năm gần đây mới phát triển mạnh

thể. Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu
nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành
một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng
của các yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng.
Tế bào nuôi cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn vì thế có thể chọn được
các cá thể đột biến nhanh hơn và hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn
giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên vẹn. Kỹ thuật nuôi cấy mô
và tế bào còn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được
những cá thể mang tính trạng mong muốn (Nguyễn Đức Thành, 2000) [8].
Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma bao gồm
nuôi cấy mô sẹo, nuôi cất tế bào huyền phù và nuôi cấy tế bào trần. Hạn
chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt
để do kích thước khối mô lớn và không đồng nhất. Để đạt được hiệu quả
cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thức nhỏ và đều nhau, kích
thước thường dùng các khối mô sẹo có đường kính 1- 3nm để xử lý và
chọn dòng chống chịu (Lê Trần Bình và đtg, 1998) [1]; Đinh Thị Phòng,
2001 [7]; Dix và đtg, 1986 [17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Người ta đã sử dụng các phương thức chọn dòng tế bào như chọn trực
tiếp, chọn gián tiếp và chọn tổng thể. Hướng nghiên cứu chọn dòng tế bào
chống chịu ở thực vật đã thu được nhiều thành tựu, trong đó đã có sự thành
công tạo ra dòng cây chịu hạn, chịu lạnh, chịu nóng.
1.1.3. Chọn dòng đậu tƣơng chịu hạn bằng kỹ thuật chuyển gen
Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu và
thành công trên nhiều đối tượng giống cây trồng như: chuyển gen thông qua
Agrobacterium tumefacins (A. tumefaciens), chuyển gen trực tiếp bằng hóa

học, việc ứng dung kỹ thuật di truyền nhằm nâng cao khả năng chống chịu
vớ các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh đã và đang thu được các kết quả
khả quan của cây trồng. Việc sử dụng các gen liên quan đến chống chịu đã
được thiết kế chuyển vào hệ thống thực vật, cải thiện mức độ chống chịu
các điều kiện bất lợi của một số giống cây trồng. Gần đây các nghiên cứu
đã phát hiện rằng sự tác động của tác nhân bất lợi có liên quan đến sự biểu
hiện của một số gen đó là: nhóm gen mã hóa protein chức năng liên quan
trong trao đổi các chất thẩm thấu, các protein bảo vệ,… Nhóm nhân tố điều
hòa sự phiên mã (transcription factors) và nhóm nhân tố tín hiệu
(singnaling factors). Ở thực vật khi bị thiếu hụt nước sẽ xảy ra sự hoạt hóa
phosphoryl hóa các protein. Một số protein kinase đã được mô tả như nhân
tố truyền tín hiệu (singnal transduction factor) liên quan đến phản ứng
thẩm thấu ở thực vật. Trong đó, SnRK2 (SNF1 – related protein kinase 2)
là protein liên quan đến các phản ứng thích nghi với điều kện bất lợi của
môi trường và nó điều hòa hoạt động bởi ABA (Umezawa và đtg, 2004
[29]; Hiroaki Fujii và đtg, 2009) [20]. Một số nghiên cứu cũng đã chứng
minh được rằng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan đến phản ứng điều kiện
khô hạn của cây trồng (Umezawa và đtg, 2004) [29]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Protein chịu nóng (Hsp) chịu nóng, muối và nhiệt độ cao, tích tụ
nước, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào (Vierling và đtg,
1992 [30], Thomashow 1998) [28]. Hsp có 5 loại: Hsp100, Hsp90, Hsp70,
Hsp 60 và sHsp. sHsp không chỉ được nhấn mạnh trong phản ứng với độ
nóng mà còn với nước, muối, quá trình oxi hóa và nhiệt độ thấp (Sabehat
và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18]. sHsp và Hsp đóng vai trò
thấp (Sabehat và đtg, 1998 [26], Hamilton và đtg, 2001) [18]. sHsp và Hsp

đậu tương mã hoá hydroxyproline giàu glycoprotein hoạt động mạnh trong
mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ. Ở rễ thứ
cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với các rễ chính. Rất có thể, sự biểu hiện
của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [9].
Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng
chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko
Watanabe và đtg (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế
liên quan đến rễ và chồi. Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các
tác giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với
các cơ chế kháng hạn. Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan
trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán.
Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên
quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương. Nghiên cứu phân lập và
đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonminori - Nhật
Bản với kích thước phân tử 1,6 kb của Nông Văn Hải và đtg (1997) [25], của
Trần Thị Phương Liên và đtg (2003) phân lập gen chaperonin CCTδ từ giống
đậu tương địa phương chịu hạn Cúc Vàng, gen này gồm 1602 nucleotid mã hoá
cho 533 axit amin [5]. Nguyễn Thu Hiền và đtg (2005) phân lập gen dehydrin
với kích thước 751 bp liên quan đến khả năng chịu hạn từ hai giống đậu tương
vàng Mường Khương và Cao Bằng 4. Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg đã phân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm
chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [3].
Hạn hán luôn là thử thách lớn đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây
đậu tương, ảnh hưởng lớn tới năng suất sinh học cũng như năng suất kinh tế
của cây đậu tương. Để khắc phục thực trạng trên thì việc nghiên cứu chọn tạo

[23] lần đầu tiên xác định được mối liên quan của expansin với sự kéo dài rễ
của cây đậu tương và cho biết mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh
trong khoảng thời gian hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo
dài rễ diễn ra rất nhanh. Phân tử mRNA của gen GmEXP1 có nhiều nhất trong
phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào và khan hiếm ở miền trưởng thành -
nơi chấm dứt sự kéo giãn tế bào. Bằng phép lai tại chỗ, tác giả nhận định, sản
phẩm phiên mã của gen GmEXP1 có nhiều trong các tế bào biểu bì và các lớp
tế bào miền sinh trưởng của cả rễ cọc và rễ bên. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy gen GmEXP1 đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây
đậu tương, đặc biệt là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp [23].
Protein EXP1 có hai vùng chức năng DPBB và Pollen allerg, số lượng
và trình tự amino acid của mỗi vùng có tính đặc trưng và quyết định mức độ
hoạt động của expansin trong quá trình phát triển của rễ cây đậu tương vẫn
chưa được làm sáng tỏ mặc dù đã được nghiên cứu nhiều. Hướng tiếp cận
nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là
sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các
lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều khiển hoạt động kéo dài và trưởng thành
của cây cũng sẽ được quan tâm.
1.2.3. Vector chuyển gen ở thực vật
Cả A.tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes đề được sử dụng để
chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-
plasmid đã được phát triển. Các vector này không chứa bất kỳ trình tự ung thư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng bình thường sau khi chuyển
DNA vào nhân của nó. Các vector này không gây ung thư hiện đang sử dụng
có thể chia làm hai loại là Cis và Trans, dựa vào việc có hay không các vùng

do hoạt động chức năng của vùng vir.
Vector biến nạp sử dụng Agrobacterium rhizogenes: các vector này
sử dụng đầu tiên khi biến nạp vào các loại thực vật mà sự tái sinh toàn bộ cơ
thể từ các tế bào đơn lẻ là khó khăn. Ở một số loài, sự tái sinh có thể xảy ra từ
sự nuôi cấy rễ gây ra bởi Agrobacterium rhizogenes thông qua sự phát triển
phôi soma hoặc sự phát sinh cơ quan. Cơ chế kiểu hình lông rễ bị ức chế làm
phát sinh hình thái chồi hiện nay còn chưa rõ, thực vật tái sinh từ lông rễ
thường bị biến đổi hình thái: lá bị gấp nếp, hệ thống rễ bị ăn nghiên, sinh
trưởng cằn cỗi khả năng sinh sản kém.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
Nguyên liệu thực vật
Sử dụng hạt của giống đậu tương chịu hạn do Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm cung cấp. Hạt có

BamHI 5325
ClaI 5362
EcoRI 5343
HindIII 5295
HindIII 5355
NcoI 4187
NotI 99
PstI 5341
PstI 5311
PstI 3808
SmaI 5333
SfiI 2290
PvuI 4813
oriV
nptIII
TrfA
RB
Nos promoter
nptIII
Nos terminator
ocd
lacZ
MCS of pBluescript
LB

Plasmid pBT Plasmid pRTRA7/3 Plasmid pCB301

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2. Hoá chất và thiết bị