ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ THU HOÀN THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmDREB2
NHẰM PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG
CHUYỂN GEN CHỊU HẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên, 2014

iLỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn là do tôi tìm
hiểu, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng
tác giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận văn đã được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn và nhóm nghiên
cứu. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn
Hoàng Thị Thu Hoàn


Tác giả luận văn
Hoàng Thị Thu Hoàn

iii

MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng iv
Danh mục hình v
Những chữ viết tắt vi
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 3
1.1.1. Cây đậu tương
3
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và cây đậu tương
8
1.2. DREB VÀ GEN DREB2 13
1.2.1. Gen DREB

2.2.1.6. Phương pháp ghép nối gen đích vào plasmid
27
2.2.1.7. Phương pháp tách chiết plasmid tái tổ hợp
28
2.2.1.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của gen
29
2.2.2. Phương pháp thiết kế vector
29
2.2.3. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào A. tumefaciens 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN
DT2008 31
3.1.1. Nhân bản gen GmDREB2 từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR
31
3.1.2. Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) của gen GmDREB2
32
3.1.3. Kết quả đọc trình tự đoạn mã hoá của gen GmDREB2
35
3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GmDREB2 38
3.2.1. Kết quả cắt plasmid pBT mang gen GmDREB2 bằng XbaI và SacI
38
3.2.2. Kết quả cắt plasmid pBI121 bằng XbaI và SacI
39
3.2.3. Tạo vector chuyển gen pBI121 mang cấu trúc GmDREB2
40
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG VI KHUẨN A. tumefaciens MANG CẤU
TRÚC GEN GmDREB2 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43
1. Kết luận 43
2. Đề nghị 43


vDANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Ảnh hạt của giống đậu tương DT2008 22
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc các vector sử dụng trong nghiên cứu 23
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen 30
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmDREB2; 31
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch đoạn mã hoá của gen
GmDREB2 32
Hình 3.3. Ảnh đĩa khuẩn lạc 33
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
tái tổ hợp chứa đoạn cDNA của GmDREB2 34
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid pBT/GmDREB2 tái tổ hợp; 34
Hình 3.6. Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmDREB2 của giống đậu
tương DT2008 và DQ054363 35
Hình 3.7. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 giữa giống
DT2008 và AAY89658 37
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm plasmid pBT/GmDREB2 được cắt bằng XbaI
và SacI 38
Hình 3.9. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pBI121 được cắt bằng
XbaI và SacI 39
Hình 3.10. Hình điện di sản phẩm colony- PCR từ khuẩn lạc mang plasmid
pBI121/GmDREB2 tái tổ hợp 41
Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ vi khuẩn A. tumefaciens
mang plasmid pBI121/GmDREB2 42

1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) còn gọi là đậu nành là cây trồng
cạn ngắn ngày mang ý nghĩa chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới do có
giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương chứa 30% - 56% protein,
chứa 12% - 25% lipid, chứa 36% - 40% hydrat cacbon và các loại amino acid
cần thiết cho cơ thể con người như: cystein, lysine, triptophan, leucine,
methyonine… Ngoài ra trong đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin (B1, B2,
C, D, E, K…) là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống của con người và
động vật. Do có thời gian sinh trưởng ngắn, trong hệ rễ lại có nốt sần mang vi
khuẩn cố định nitơ không khí nên cây đậu tương thường được trồng luân canh
với lúa và ngô để tăng vụ, cải tạo đất bạc màu và bảo vệ môi trường.
Cây đậu tương đang trở thành một trong những cây trồng quan trọng
không chỉ đối với Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm của
nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu quan trọng
cho nhiều ngành công nghiệp.

Trong những năm gần đây hạn hán xảy ra thường xuyên đã tác động
xấu đến sự sinh trưởng, phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng
trong đó có đậu tương. Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh và thuộc vào nhóm cây chịu hạn kém, khi thiếu nước ở các thời kì
khác đều có tác động xấu, làm giảm năng suất cây đậu tương.
Đặc tính chịu hạn ở đậu tương là tính trạng đa gen mà sản phẩm của
các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện tính chịu hạn hoặc có chức
năng điều hoà nhóm gen chịu hạn. DREB là một loại protein điều hòa có chức
năng kích thích hoạt động phiên mã của nhóm gen chịu hạn, đây nhân tố

2

phiên mã đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của nhóm gen chịu hạn

1.1.1. Cây đậu tương
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử
dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm
được xác minh. Cây đậu tương có nguồn gốc từ Trung quốc và nó sớm được
người dân thuần hóa và trồng làm cây lương thực vào khoảng thế kỉ 17 trước
công nguyên. Sau đó, nó được đưa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam
Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa. Đậu tương truyền bá sang Châu Âu
vào khoảng thế kỉ thứ 17, sang Hoa Kì thế kỉ thứ 18 và ngày nay Hoa Kì là
quốc gia sản xuất đậu tương hàng đầu trên thế giới, chiếm 50% sản lượng trên
toàn thế giới, tiếp theo là các nước Trung Quốc, Ấn Độ,… Ở trung du Việt
Nam đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực
trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ [3], [5].
Cây đậu tương hay đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill,
thuộc chi Glycine, họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoideae), bộ
Phaseoleae và có bộ NST 2n = 40. Đối với đậu tương có thể phân loại theo đặc
điểm thực vật học, dựa vào thời gian sinh trưởng, theo thời vụ. Theo cách phân
loại của Hymowit và Newell (1984) dựa trên đặc điểm về hình thái, sự phân bố
địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja.
Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được
chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Gtycine (L) Merr và loài hoang dại hàng
năm G. Soja Sieb và Zucc [3], [5], [9].

4

Cây đậu tương gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ
đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi
khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo
thành đạm dễ tiêu. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay
nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, khí hậu và kĩ thuật trồng. Trong giai đoạn
sinh trưởng sinh dưỡng, sinh trưởng của rễ nhanh hơn thân, nên khi vào thời

thường. Đậu tương thường có 3 lá chét sau cặp lá đơn và được xếp xen kẽ
thành 2 hàng đối diện. Phiến lá chét có hình ô van rộng tới hẹp tùy thuộc vào
từng loại giống. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Những giống có lá nhỏ và
dài chịu hạn khỏe nhưng cho năng suất thấp. Còn những giống có lá to chống
chịu hạn kém nhưng lại cho năng suất cao. Lá gốc xuất hiện ở cuống của mỗi
cành, là một lá đơn rất nhỏ. Lá gốc không có cuống và lá gối [3], [5].
Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa dạng cánh bướm đặc trưng, hoa
đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ
nách lá hoặc ngọn. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 - 10 hoa và
thường có 3 - 5 hoa. Hoa đậu tương nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp do chịu
nhiều ảnh hưởng từ môi trường [9], [14].
Quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông
khi chín có màu vàng hoặc xám. Quả đậu tương có số lượng biến động từ 2
đến 20 quả trên một chùm hoa và có thể có 400 quả trên một cây. Một quả
thường có từ 1 đến 5 hạt, nhưng chủ yếu là 2 đến 3 hạt. Hạt đậu tương không
có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn
hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng
nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số là hạt màu vàng. Trong hạt, phôi
thường chiếm 2%, lá mầm chiếm đến 90% và còn lại là vỏ hạt chiếm 8% tổng
khối lượng hạt [3], [5].

6

Đậu tương là cây trồng có giá trị kinh tế cao, nó được dùng làm thực
phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là
hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt. Đậu tương có hàm lượng protein cao
hơn trong gạo, thịt, cá và cao gấp hai lần các loại đậu đỗ khác. Trong hạt đậu
tương không có thành phần cấu tạo của cholesteron. Đậu tương còn được xem
là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tương chứa thành phần các
acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Hạt đậu tương

Việt Nam. Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động
và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu
tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013

2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Diện tích
(1000 ha)
190,1 192,1 146,2 197,8 173,6 200 230
Năng suất
(tấn/ha)
1,45 1,39 1,46 002 1,46 1,5 1,52
Tổng sản lượng
cả năm (tấn)
275,5 267,6 213,6 296,9 254,2 300 350
Nguồn: Tổng cục thống kê [38]Do chưa được đầu tư cao nên năng suất đậu tương còn nhiều hạn chế.
Năng suất đậu tương của nước ta rất thấp, chỉ bằng 50 – 70% năng suất đậu
tương của toàn thế giới. Sản lượng đậu tương sản xuất ra chưa kịp đáp ứng
nhu cầu trong nước. Hàng năm, chúng ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng
đáng kể từ nước ngoài. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên, có thể
là do dịch bệnh, kỹ thuật canh tác, nhưng chủ yếu là do biến đổi khí hậu và
hạn hán. Cùng với việc nghiên cứu các công nghệ sinh học và các loại đậu

8

tương cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phí sản xuất
thấp, các nhà chọn giống Việt Nam còn quan tâm nghiên cứu các giống đậu

Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối
ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực
vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là
tính chịu hạn [15], [17].
Khô hạn có thể phân ra làm các trường hợp sau:
(i) Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở
giai đoạn nhất định trong chu kì sống ở thực vật (hạt, hạt phấn, bào tử). Hiện
tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình
biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di
truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt nếu tế bào mất nước khả năng chịu hạn
tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm
dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt điều
kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió.
(ii) Hạn do tác động của môi trường chịu tác động bên ngoài rất lớn,
gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể gây hủy hoại cây cối và gây mất
mùa. Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước
đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế
bào. Những yếu tố bất lợi chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ,
gió nóng hay thời tiết, khí hậu. Có hai loại hạn do môi trường tác động là hạn
đất và hạn không khí.
(iii) Hạn đất thường xảy ra ở những vùng có khí hậu hay thổ
nhưỡng đặc thù, hạn tác động mạnh mẽ lên bộ rễ của cây. Sự tác động này
được biểu hiện qua sự điều tiết các hoocmon giúp cho cây chống chịu với
điều kiện cực đoan.

10

(iv) Hạn nhiệt độ không khí thường xảy ra ở những vùng có gió nóng,
nhiệt độ cao. Hạn không khí thường tác động lên các bộ phận trên mặt đất
như lá, hoa. Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tượng mất nước

nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Căn cứ vào
đặc điểm này, đậu tương được chia thành hai nhóm:
- Nhóm chịu được sự mất nước trong từng giai đoạn phát triển của cây.
- Nhóm chịu được sự thiếu nước trong tất cả giai đoạn phát triển của
cây.
Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tương có thể dễ vượt qua hơn,
còn ở những giai đoạn sau như giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp
hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giảm đáng kể.
Signh và Sarkar (1991) chia cơ chế chịu hạn ở thực vật làm 3 loại:
- Tránh hạn: là khả năng của cây có thể hoàn thành chu kỳ sống của nó
trước khi sự thiếu hụt nước xuất hiện.
- Chịu hạn: là khả năng của cây có thể sống, phát triển và cho năng suất
trong điều kiện cung cấp nước hạn chế hoặc thụ động trải qua các giai đoạn
thiếu nước và tiếp tục phát triển khi điều kiện trở lại bình thường.
- Chống hạn: là khả năng của cây trồng chống lại sự thiếu hụt nước
bằng cách duy trì nước trong mô tế bào cao [6], [9], [13].
Đã có rất nhiều công trình khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính chịu
hạn của cây đậu tương nhằm góp phần quan trọng trong công tác chọn giống.
Năm 2004, nhóm nghiên cứu gồm Huang và cs của trường Đại học Tự
nhiên và Kỹ thuật Pingtung - Taiwan đã phân lập được gen P5CS ở đậu tương từ
mRNA với kích thước 2148 bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng
hợp proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên [6].

12

Prorcel và cs (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tương
và đăng kí trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thước
là 831 bp [35].
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thúy Hường và cs (2009) đã phân lập gen
P5CS từ mRNA với kích thước 2148 bp [34].

trên vùng khởi động gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức
hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng. Nhóm gen mã hóa các
nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò
quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và
chống chịu với bất lợi môi trường. Ở đậu tương, hơn 2000 yếu tố phiên mã từ
các mô cơ quan chính đã được xác định, khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ
liên quan đến tính chịu hạn. Các nhà khoa học đã xác định các nhân tố tham
gia vào quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn là DREB, ADREB, NAC,
bZIP, ZFHD…
DREB là họ gen tổng hợp protein được tìm thấy nhiều trong tế bào
sống khi thực vật gặp các điều kiện bất lợi như hạn hán, mặn và lạnh. Nhiều
công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng DREB là
nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt
nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều
kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh. Khi nghiên cứu cấu
trúc protein họ DREB đã cho thấy rằng chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất
để gắn với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF, cho phép chúng tương tác với
một loạt các gen phía sau theo hình thức không phụ thuộc ABA. Các miền
AP2/ERF khá bảo thủ và có khoảng 60 amino acid [21], [24], [27].
Shahrokhabadi và cs (2008) đã xác định được các gen trong họ gen
DREB ở đậu tương.
Trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự lõi là
A/GCCGAC lần đầu tiên được phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen rd29

14

ở Arabidopsis và sau này được phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen
của các gen biểu hiện trong điều kiện hạn và lạnh khác (Huang B, 2007) [27].
Dubouzet và cs (2003) cho rằng gen OsDREB1A, OsDREB1B,
OsDREB1C, OsDREB1D, gặp lạnh, OsDREB2A được biểu hiện khi mất

mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nước.
Gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn. Gen DREB2 được biểu
hiện trong môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.
Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên
quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen. Trong cây
Arabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nước đặc trưng bởi một nhóm gen
DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B. Khi phân tích thấy rằng
cả hai gen được gây ra bởi sự mất nước và độ mặn cao. Mức độ biểu hiện của
hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây bị mất
nước. Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3, cả 2
gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [33].
Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra Beta-
glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nước và độ mặn cao [33].
Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa
trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong
gen GmDREB2 nhóm gen DREB. Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong
môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB [23].
Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen được tích lũy cao hơn
của hàm lượng proline [31]. Đối với cây đậu tương với chức năng kích hoạt
sự phiên mã của là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng
chịu hạn của cây.

16

Liu và cs (2008) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc
Dendranthema vestitum. DvDREB2A được phân lập từ hoa cúc
Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366 amino
acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự.
Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA - binding miền gần khu
vực N. Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố