1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị
kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải
tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu
tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của
giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác
động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ
bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus
– SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –
BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những
loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương.
SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là
môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có
những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng,
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và
biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV
gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương.
Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi
ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc
nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và
chất lượng hạt [95].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các
biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh
đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt
trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và
nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân
tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen
CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.
3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và
tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.
3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp
vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens.
3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn
gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ
thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen
so với cây đối chứng không chuyển gen.
3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens.
Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương
chuyển gen.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720
nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã
được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.
4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và
BYMV.
4
4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40)
thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae). Đậu tương là
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất. Hạt đậu
tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho
hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin,
tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức
năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức
khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể
so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82].
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây
hàng năm. Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ
tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm
[1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều
lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu
tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang
một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ
nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm,
có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn
tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng
và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có
lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Quả thẳng
6
hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu
trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại
lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại những nơi bị nhiễm bệnh
nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên
đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm [17]. Một số nước
có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ
(37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-
50%) [28], [80], [158].
Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh
được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu
tương đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [80]. Việt
Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung
ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ,
khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [1], [12].
Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm,
gây hại trên cây đậu tương, trong đó có SMV và BYMV [17], [73]. SMV là
loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ
Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương,
bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44]. SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất,
thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu
tương. Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển
chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn
sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [85] [86]. Họ Potyviridae được biết
đến là có số lượng loài lớn nhất trong các loài virus gây bệnh ở thực vật. Nếu
nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng
hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145]. Những cây bị nhiễm Potyvirus
cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145]. SMV có thể lây nhiễm qua hạt với
tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật và thời
gian bị nhiễm [104].
8
9
mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ
thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành
ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được
nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng
truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn
trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [12], [13].
SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ
xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt
phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất
và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày
virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá
kép và một phần đoạn thân sát gốc [80], [145]. Sau 5 ngày virus nhiễm hết
dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn
bộ cây. Virus có thể nhiễm qua nhân giống vô tính, qua hạt giống, qua phấn
hoa, hoặc qua côn trùng [108]. Cách thức truyền virus gây bệnh qua trung gian
làm cho cây đậu tương có khả năng nhiễm bệnh rất cao, khi cây trưởng thành
có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau
[80], [161].
SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là
protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [80], [91]. Hệ gen của SMV và
BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)). Đời sống của Potyvirus sau khi
xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã,
xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ
thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và
các cây khác [145]. Quá trình xâm nhiễm của SMV và BYMV cùng với quá
trình nhân lên của RNA được mô tả ở hình 1.1.
11
đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của các chủng SMV G2 và G7
và trình tự CP của của một số chủng SMV cũng được mô tả [93]. Các vùng
trong hệ gen của các Potyvirus chứa hầu hết các gen mã hóa protein thể vùi ở
dạng hình trụ (Cl), gen RNA polymerase - phụ thuộc- RNA (POL hoặc Nib
và gen protein vỏ (CP) [93], [132]. Các protein 21K và 27K ở SMV là giống
như protein NIa ở TEV và VPg, NIa, PI, P3 và HC-Pro là các loại protein
chịu trách nhiệm về hoạt động xử lý protein sau khi được tổng hợp [61], [93].
Nghiên cứu của Jayaram & đtg (1992) lưu ý rằng sự khác biệt lớn nhất
về trình tự NIa giữa các dòng SMV G2 và G7 biểu hiện ở vùng đầu 5' của hệ
gen virus, chủ yếu ở ở các gen PI, P3, Cl và HC - Pro của hệ gen virus [93].
Kim & đtg đã sử dụng enzyme giới hạn EcoRI để cắt các sản phẩm RT-PCR
của gen Cl phân lập từ SMV và phân biệt được năm chủng (G5H, G5, G3, G6
và G7) [102]. Các chủng gây bệnh đốm vòng đu đủ Potyviruses và virus khảm
xà lách cũng đã được phân loại bằng cách sử dụng enzyme giới hạn [35], [109].
Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10
chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro),
Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6
kDa protein 2 (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion
protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) (Hình
1.2). Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm
10 chuỗi polypeptid giống như ở SMV [182].
Won-Seok Lim và đtg (2003) đã thông báo trình tự nucleotide hoàn chỉnh
của hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide
(chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một
polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng. So
sánh trình tự amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho
thấy sự tương đồng lớn giữa chúng. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và
13
một chất ức chế sao chép, hạn chế phản ứng phòng vệ và vận chuyển trong
cây chủ [99]. HC-Pro của virus khảm đậu tương ức chế sự tích lũy mRNA ở
cây chủ trong sự thúc đẩy việc lây nhiễm virus ở phôi hạt đậu non [164].
Vùng trung tâm của HC-Pro có chức năng trong sự di chuyển của virus trong
cây thuốc lá và có liên quan đến sự ức chế làm bất hoạt gen sau phiên mã
[99]. Mặc dù đã có nghiên cứu về gen Rsv4 kháng SMV trên cây đậu tương,
nhưng vai trò tiềm năng của HC-Pro trong sự tương tác của SMV với cây đậu
tương vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.
Chức năng của sản phẩm từ gen P3 không được biết nhiều, nhưng nó
được cho là có vai trò trong sự lây nhiễm của virus và được minh chứng bằng
kết quả nghiên cứu đột biến liên quan đến việc gây cảm ứng héo ở cây [159].
Gen mã hóa protein Cl của các Potyvirus có chức năng trung gian trong
sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác trong cây chủ. Sự thay thế
amino acid ở vùng đầu N của protein Cl đã ức chế sự di chuyển của virus trong
cây Nicotiana tabacum Xanthi [47]. Protein Cl của Potyvirus hạn chế các cấu
trúc có tổ chức đặc biệt, các thể vùi, gắn vào plasmodesmata ngay sau khi
nhiễm virus [90].
Gen NIa mã hóa protein NIa bao gồm cả VPg và miền proteinase ở vùng
đầu C. NIa nằm ở thể vùi trong nhân tế bào bị nhiễm. VPg của nhiều Potyvirus
được cho là có liên quan đến sự di chuyển của virus [140], [116]. VPg liên kết
với màng và có liên quan đến việc nhân lên của virus [135]. NIb là RNA
polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) cần cho sao chép của hệ gen và protein
này có liên quan đến hoạt động liên kết với RNA [159].
Bằng chứng về tầm quan trọng của VPg là sự kháng lại sức đề kháng
đối với Potyvirus của thực vật khi nghiên cứu TVMV ở các giống thuốc lá
Burley TN86 [119] và ở Pea seed-borne mosaic virus (PSMV; chi Potyvirus)
trên cây Pisum sativum [100]. Những phát hiện từ kết quả nghiên cứu TVMV
các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng là 38% - 71% được nhận dạng
là các loài virus khác nhau; còn các thành viên có trình tự với hệ số tương
đồng ít nhất là 90% được nhận dạng là cùng chủng virus [144].
Trình tự gen CP phân lập từ bốn chủng SMV đã khẳng định vị trí của
gen CP ở vùng đầu 3, tiếp theo là vùng chưa dịch mã (UTR) và đến đuôi
polyA [93], [132]. Trong vùng đầu N của CP ở Potyvirus, bộ ba amino acid
DAG được biết là có liên quan đến côn trùng truyền bệnh và các vùng của CP
giữ vai trò khác nhau đối với sự di chuyển của virus trong tế bào [92]. Bộ ba
amino acid GRD ở vị trí 2120 đến 2122 trong protein VPg tồn tại giống nhau
ở một số Potyvirus khác nhau [82]. Bộ ba amino acid GRD có ở SMV G2,
nhưng không có ở SMV G7, trong đó lysine được thay thế cho arginine tại vị
trí amino acid 2121, kết quả tạo ra bộ ba GKD. Sự thay thế amino acid này có
liên quan với khả năng kháng SMV chủng G7 ở cây đậu tương [93].
Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804
nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP
được gọi là vùng Poty-coat [93]. Ở BYMV, gen CP có kích thước 933
nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong
đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272 [103]. Các số liệu so sánh
cho thấy có sự khác biệt lớn về kích thước và trình tự amino acid của CP, tuy
nhiên lại có sự tương đồng cao về trình tự ở vùng đầu C của CP [75].
Các chủng virus cũng được phân biệt bởi những thay đổi trong hệ gen
của chúng. Sử dụng enzyme giới hạn RsaI và HinfI cắt sản phẩm PCR khuếch
đại gen CP từ Citrus tristeza virus (Chi Closterovirus) kết quả cho thấy đã có
sự thay đổi về trình tự gen CP [74]. Sự khác biệt được xác định bằng phương
pháp PCR có liên quan chặt chẽ với sự khác biệt về mặt sinh học của virus gây
bệnh đốm vòng (Chi Ilarvirus) [77]. Phân tích sự phát sinh loài cũng được sử
dụng để phân biệt Potyvirus khác nhau [35], [132].
16
1.2 . NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.2.1.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen vào phôi soma đậu tương
Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển đoạn DNA trực tiếp vào tế bào
thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý, trong đó kỹ
thuật chuyển gen bằng súng bắn gen đã được ứng dụng thành công ở cây đậu
tương [171].
Chuyển gen bằng súng bắn gen ở thực vật là kỹ thuật dẫn các hạt nhỏ
bằng vàng hoặc bằng tungsten được bọc bởi gen chuyển vào tế bào, mô đích
[50], [171]. Ưu điểm của phương pháp bắn gen là thao tác dễ dàng, bắn một lần
được nhiều tế bào, nguyên liệu để bắn gen đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy,
tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh). Giống đậu tương chuyển gen đầu
tiên được tạo ra bằng kỹ thuật sử dụng súng bắn gen từ năm 1988, đến nay
phương pháp chuyển gen này đã được cải tiến, phát triển và áp dụng cho hầu
hết các giống đậu tương [117], [171], và hàng loạt các công bố về biến nạp
thành công trên cây lúa, đu đủ, mía, bông,… những kết quả này đã khẳng định
tính ưu việt của phương pháp bắn gen. Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm.
Kể từ khi súng bắn gen được sử dụng lần đầu tiên trên cây đậu tương,
kỹ thuật chuyển gen đã đạt được thành công đối với phôi mầm hạt chưa chín
[117], phôi soma [66] và đỉnh mô phân sinh [30]. Phôi soma được tạo ra từ lá
mầm non nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ cao và
được sử dụng để tạo ra các phôi mầm có thể tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh
[66]. Vì quá trình hình thành mô phân sinh phụ thuộc vào kiểu gen cho nên
chỉ có một số ít giống đậu tương sử dụng chuyển gen thành công. Căn cứ vào
tiềm năng của phôi soma, phôi tăng sinh và tái sinh cây mà giống đậu tương
“Jack” được xem là có đủ các đặc tính cần thiết cho chuyển gen và được sử
18
dụng để tạo ra cây đậu tương chuyển gen [154], bởi sự thay đổi quy trình nuôi
cấy mô chỉ có thể khắc phục được một phần ảnh hưởng của kiểu gen đến hiệu
quả chuyển gen. Phôi soma là một đặc tính di truyền nhưng cũng có thể cải
quan đến đặc tính, tính trạng quan tâm và phân lập gen; (ii) Thiết kế vector
chuyển gen; (iii) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (iv) Lây nhiễm vào
mô tế bào thực vật; (v) Chọn lọc các thể biến nạp và tái sinh cây biến nạp; (vi)
Phân tích cây chuyển gen.
Agrobacterium là loài vi khuẩn đất Gram âm gây bệnh khối u ở thực
vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên giữa các loài thực vật khác
nhau [58]. Agrobacterium có thể gây ra bệnh khối u (A. tumefaciens) và gây
bệnh rễ tơ (A. rhizogenes) phổ biến trên nhiều loài thực vật [72]. A.
tumefaciens chủ yếu lây nhiễm vào thực vật qua các vết thương và do vậy có
thể coi A. tumefaciens là một công cụ sử dụng để chuyển các gen mong muốn
vào cây đậu tương [37]. Ưu điểm của phương pháp chuyển gen thông qua A.
tumefaciens là đơn giản, quen thuộc và yêu cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng
chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ cần số bản copy thấp [79].
Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở đậu tương trong môi trường đồng
nuôi cấy được tiến hành trên nách lá mầm [87] mà khởi nguồn phương pháp
này dựa vào kiểu gen đậu tương mẫm cảm với A. tumefaciens và khả năng tái
sinh cây từ nách lá mầm [123]. Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm và thân
chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường
nuôi cấy chứa cytokinin. Mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm phụ thuộc vào
loại cây sử dụng chuyển gen. Nhìn chung gây tổn thương nách lá mầm bằng
các vết cắt và kim châm đòi hỏi phải có kỹ thuật và sự khéo léo để tạo ra đủ mô
đích cho sự nhiễm khuẩn [181]. Tuy nhiên, nếu sử dụng bàn chải làm từ thép
không gỉ để tạo các vết thương ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt
kỹ thuật [171].
20
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên mang cấu trúc gen npII đã
sử dụng kháng sinh kanamycin làm chất chọn lọc [87] và đến nay các dòng tế
bào chuyển gen đã sử dụng các chất chọn lọc bởi sự kết hợp gen bar và
glufosinate. Nồng độ chất chọn lọc có ảnh hưởng lớn đối với tần suất chuyển
Hình 1.3. Sơ đồ các bước chuyển gen và phương pháp phân tích cây chuyển
gen
Quá trình tạo cây chuyển gen đòi hỏi một phương tiện hiệu quả để xác
định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ
thống chuyển gen được sử dụng. Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng gen
kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ sẽ cho phép chọn được các vật
liệu biến đổi gen [43]. Kháng sinh hygromycin đã được sử dụng thành công
như một nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn
lọc các mô chuyển gen ở đậu tương, đặc biệt là các mô phát sinh phôi [88],
[111] và các tế bào của nách lá mầm đậu tương [122]. Điều này đã chứng
minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm
giảm thời gian nuôi cấy. 22
Biện pháp tăng hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương qua nách lá mầm
được thực hiện bằng cách sử dụng mức tối ưu glufosinate [176], đồng thời
phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR, real-time RT-PCR, thực hiện lai
Northern blot. Đối với các bệnh do virus ở thực vật người ta có thể sử dụng
kỹ thuật real-time RT-PCR để đánh giá cây chuyển gen kháng virus thông qua
phiên mã để phát hiện và định lượng virus trên cây nhiễm bệnh [137]. Để
đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số
kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai Western blot, ELISA và các kỹ thuật phát
hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme).
1.2.2. Định hướng ứng dụng và thành tựu nghiên cứu chuyển gen ở cây
đậu tương
1.2.2.1. Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện các thành phần của hạt
Cải thiện hàm lượng và chất lượng protein
Kỹ thuật chuyển gen được ứng dụng nhằm tăng cường hàm lượng, chất
lượng protein trong hạt đậu tương. Protein đậu tương có hàm lượng dinh
dưỡng được xem tương đương với protein của thịt và trứng, ngoại trừ sự khác
biệt về amino acid chứa lưu huỳnh đặc biệt là methionine [65]. Vì vậy để tăng
cường các loại protein có hàm lượng methionine cao ở hạt đậu tương, người
ta đã chuyển gen mã hóa β-casein phân lập từ trâu, bò và zein phân lập từ ngô
vào cây đậu tương theo nguyên tắc thiết kế vector chuyển gen chứa promoters
biểu hiện ở hạt [112]. Mặc dù chưa có thông tin về hiện tượng tăng hàm
lượng amino acid tự do chứa các gốc lưu huỳnh trong hạt đậu tương, nhưng
ba loại amino acid quan trọng khác là lysine, tryptophan và threonine đã tăng
đáng kể trong hạt đậu tương bởi sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme liên
quan đến chuỗi phản ứng tổng hợp các amino acid này [130]. Cải thiện hàm
lượng các loại amino acid trong hạt đậu tương được xem là một cách tiếp cận
đáng tin cậy để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu tương.
24
Đậu tương cũng được xem là một lò phản ứng sinh học sản xuất protein
có hiệu quả nhất trong các cây trồng nông nghiệp. Các protein có hoạt tính
dược học như hormone sinh trưởng người, nhân tố sinh tế bào sợi và vaccine
Vitamin E bao gồm các dạng khác nhau như tocopherols và
tocotrienols (dạng , , và ). Tất cả đều có khả năng chống oxy hoá lipid,
trong đó mạnh nhất là -tocophetal [42], [82]. Vitamin E được dùng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm như chất chống oxy hoá, đồng thời cũng được
dùng cho người và động vật để giúp phòng bệnh. Trong chế biến đậu tương,
tocopherols được chiết xuất cùng dầu. Thành phần của chúng chỉ chiếm 1,5%
hàm lượng dầu được chiết xuất, nhưng chúng có vai trò quan trọng đối với sự
ổn định và không bị oxi hoá của dầu [89]. Tác động vào bước chính để
chuyển đổi -tocophenol sang -tocophenol làm tăng hàm lượng -
tocophenol lên 95% của tocophenol toàn phần trong hạt đậu tương chuyển
gen [153].
Cải thiện một số thành phần khác
Isoflavones là các thành phần quan trọng được tổng hợp trong cây họ
đậu. Ngoài vai trò kiểm soát quá trình tương tác giữa cây và vi sinh vật,
chúng còn được biết đến như chất nội tiết phyloustogen và các chất hoạt tính
sinh học khác liên quan đến sức khoẻ con người, như có hiệu quả chống ung
thư, giảm nguy cơ bệnh mạch vành [143]. Saponins là một nhóm chất có cấu
trúc đa dạng phân bố nhiều trong các loài thực vật. Dựa trên cơ sở cấu trúc
hoá học người ta đã xác định saponins ở đậu tương được phân bố trong bốn
nhóm (A, B, E và DDMP) và chúng có tác dụng dược học khác nhau như
chống phù lipid, chống lại sự nhân lên của tế bào ung thư trực tràng. Theo
Takagi và đtg (2011), gen mã hóa -amyrin synthase tham gia tổng hợp một
loại chất trong quá trình sinh tổng hợp saponins của hạt đậu tương chuyển gen
đã bị ức chế bởi cơ chế RNAi [152].
Copyright: Tài liệu đại học ©