1

M U

t v
Nghiên cu bn cht tính chng chu ca cây trng cho thy
t tính tr th ca tng gen riêng r liên
n tính chng chu  thc vt (ví d c
nhiu nghiên cu tìm hiu và phân tích. Dng ca các yu t
bt li t ngoi cnh, không ch các gen riêng r c biu hin mà
là mt h thc kích hot biu hin nh
ng vi tình trng bt li mà thc vt gp phi. Mt trong s nhng
yu t kích hot hong ca các gen liên n kh ng
chu là các nhân t phiên mã (transcription factor  TF).
 NAC 
TF   . NAC
TF có  ng 
.  
khác nhau     Nhiu tác gi 
nghiên cu chuyn gen mã hóa NAC TF thành công vào mt s loài
cây tr, thuc lá cây lc, các gen AhNAC1,
AhNAC2, AhNAC3  
thành công, AhNAC2 
Arabidopsis.
Lc là cây nông nghip ngc trng ph bin trên
th gii.  c ta, cây lc trng trên khp các min và phù
hp vi nhiu vùng sinh thái khác nhau. Cây lc là cây h u, thuc
nhóm chu hn kém. Vì vy, nu ci thic kh ng chu
s m rc dit cây
2


 u hn ca các dòng thuc lá chuyn gen thông
qua s ng proline. Phân tích biu hin protein tái t
hp NAC2  cây thuc lá chuyn gen.
(5) Phát trin h thng tái sinh cây  cây lc và chuyn gen ch th
(GUS) qua mô so và phôi soma.
(6) Chuyn cu trúc gen NAC2 vào cây lc, phân tích các dòng
lc chuyn gen.
4. Nhi ca lun án
i) Tách dòng thành công gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2
t ging lc chu hn tt L12.
ii) Thit k thành công vector cha cu trúc mang gen mã hóa
nhân t phiên mã NAC2 và chuyn vào cây thuc lá, kt qu biu
hin protein  cây chuyn gen chng minh ct k hot
ng tt  thuc lá.
iii) Thông qua h thng, ging lc LVT
c th nghim chuyn gen GUS và chuyn cu trúc mang gen mã
hóa nhân t phiên mã NAC2. Biu hin GUS  c trên phôi
soma và cây lc hoàn chc 4 dòng lc  th h T0 mang
gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 qua kiu vi phn
ng PCR.
iv) Lun án tc quy trình chuyn gen
hoàn chnh thông qua mô so và phôi soma  cây lc nhm phc v
to cây lc chuyn gen theo mi thin kh ng chu
vi tình trng thic t ng.
c và thc tin
5.1. Ý nghĩa khoa học
4

i) Kt qu nghiên cu ca lun án cung cp dn liu khoa hc
v ng dng k thut chuyn gen nhm phc v vic ci thin tính

gii. Xu th bi  i chung ca khí hu làm cho hn hán bt
ng xy ra  nhi
sut cây trc. Nhng hiu bit v  chu
hn giúp hiu rõ v c tính chng chu ca thc vt và cây l
   trong nhng nghiên cu v kh   ng vi tình
trng thic t ng.  chu hn ca thc vt rt
phc tp, không ch m hình thái gii phu mà
n nhi thành phn hoá sinh trong t bào,
s u chnh hong cn tính chu hn ca thc
vt. Thành công ca k thut chuyc công b trên nhiu
loài cây trng và nhin kh u hn ca
thc vc ci thin.
Hing tìm kin tính
chng chu ca cây trni vu kin sinh thái phi sinh hc bt
l ng th nht là tìm nhng gen liên quan trc ti n kh
u hn, chu lnh, ngp úng hay phèn mng th hai
nghiên cu v gen chng chng các yu t u khin ví d
iption factor (TF) nhm tip cu hòa tng th
 a thc vt khi gu kin bt li.  NAC  
TF   . 
mã NAC có liên quan v chvi nhiu quá trình khác nhau
trong  thc vt, phát trin, quá trình lão hóa, 
ng các stress sinh hc và phi sinh hc. Nhiu nghiên cu ch yu
tp trung vào to dòng và phân ln hn hán
6

trong h    ANAC019, ANAC055, và ANAC072 
Arabidopsis, BnNAC   , AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3,
AhWSI 153, AhWSI 308  cây  GmNAC2, GmNAC3 và
GmNAC4 tr  , ONAC045, SNAC1  lúa, TaNAC2,

 u hn  n cây non theo
Lê Tr.
ng proline ba 
2.3 dng trong nuôi cy in vitro
To các dòng thuc lá và lc bng k thut nuôi cy in vitro.
Ging thuc cung cp t phòng Công ngh t bào
thc vt vic 3-4 lá thc s d
tin hành các thí nghim phc v cho chuyi và
chuyn gen, to cây hoàn chnh.
 lc qua mô so hóa và phôi soma
c tin hành da mt s tác gi .
To mô so trong ti 10 ngày, to phôi soma trong 7 tun, tái sinh
cây và to cây hoàn chnh.
n gen thông qua mô sc tin hành da
trên nghiên cu ca mt s tác gi.
2.3c phân t
Nghiên cu thông tin v gen và thit k cp mi nhân gen: Các
c thao tác: i) thu thp trình t nucleotit t ngân hàng gen NCBI;
ii) thit k cp mi; iii) Kim tra chng cp mi bng PCR.
Tách chit DNA tng s .
Tách chit RNA tng s bng Trizon. c tng hp theo quy
trình RevertAid
TM
H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit.
8

Phân lp gen bng k thut PCR, RT-PCR. Tách dòng gen
pháp c
nh trình t gen trên máy phân tích trình t t ng theo
a Sanger.

thí nghim sau này trong vi u hn ca các
ging lc. Chúng tôi s dng ngun mu t phôi trc ht lc
ng có b sung chng 2,4D.
Kt qu nghiên cu cho thy, tt c các ging lc nghiên cu
u có kh o mô so. Kh o mô so cao nht quan sát
thy  ging L12

và L16 (100%), thp nht là ging LVT (69,56 %).
Ngun mô so thu nhn s c s dng trong các thí nghim
 u hn ca các ging lc  n này.
3.1.1.2. Khả năng giữ nước của mô sẹo các giống nghiên cứu
  mc ca mô so chúng tôi tin hành x lí
thi khô c khi mô so và chia tách mô so vi các t l khác nhau
(1/2, 1/4, 1/8) bng lung khí vô trùng ca box cy. Tin hành thi
khô 3h, 6h, 9 h liên t mc ca mô so.
Kt qu thí nghim cho th  m c ca mô so các
ging lc sau x lý bi th   i khác nhau tùy vào mi
ging. T mc nhanh nht quan sát thy sau 3h thi khô
c ca mô so gi tt c các ging.
T mc sau 3h th nguyên c khi mô so là ít
i mô so thng
 mc cao nht và gi mc thp nht là L12
sau 3h thc tip tc gim sau 6h thi khô tip theo
so vi trng mô su.
10

3.1.1.3. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo các giống nghiên cứu
Kh  c ca mô so các ging nghiên cu sau x lý
bi thi khô n t l sng sót ca mô so.
T kt qu x lý mc mô so cho thy, t l sng sót ca

u hn càng cao.
Hàm lượng proline của các giống lạc trước và sau xử lý hạn
Hàm ng proline c  tiêu quan trng trong
 u hn hành phân tích hàm
ng proline  n cây non  thc hn và sau hn.
u phn ng ca cây tri vi các yu t
cng. Kt qu thí nghim cho thng
proline sau hu so vc khi gây hng
L12 có t l t (394,12%) còn ging TB25 có t l 
thp nht (241,67%). Các ging L12, L16, MD7, L20 chu hn tt
ng proline i các ging còn li.
3.1.3. Phân nhóm các ging lc theo kh u hn
Nhm kho sát mi liên quan gia kh u hn ca các
ging nghiên cu vi các ch á  m mô so và cây
non, chúng tôi s dng phn m phân tích các ch
tiêu này, kt qu có th chia 10 ging lc nghiên cu thành 3 nhóm:
Nhóm chu hn tt gm 2 ging: L12, L16; Nhóm chu hn
Khá gm 4 ging: L20, MD7, L14, Sen lai; Nhóm chu hn yu gm
4 ging: L08, L15, LVT, TB25.
3.2. Kt qu nh trình t gen NAC2
3.2.1. Nhân dòng gen NAC2
Da trên trình t gen AhNAC2 ca cây l ti Ngân
hàng Gen quc t (EU755023), cp m c hi c chúng tôi
thit k  nhân gen NAC2. T lá ca ging l lý
12

hn, RNA tng s c tách chit và tng hp cDNA. Gen NAC2
c nhân lên bng k thut PCR và kim tra bn di trên gel
agarose. Kt qu trên hình 3.4 cho thc có kích
ng vc tính toán theo lý thuyt (1050 bp).

2
232
A
G
3
249
A
T
4
264
A
G
5
288
A
G
6
291
T
C
7
297
A
G
8
343
G
A
9
1044

        i gen AhNAC2  
    NAC2       
AhNAC2 và gt vi GmNAC4  NAC2 

NAC2 

3.3. Thit k vector chuyn gen mang gen mã hóa nhân t phiên
mã NAC2 và chuyn vào cây thuc lá
3.3.1. Thit k vector tái t hp cha cu trúc gen mã hóa nhân
t phiên mã NAC2
Da trên trình t gen AhNAC2  trên ngân hàng gen
(No. EU755023) chúng tôi thit k 2 cp mi nhân gen NAC2 
ging lc chu hn tm ct ca các enzyme NcoI/NotI
và XbaI/SacI m ct ca NcoI/NotI c s dng trên vector
pRTRA7/3, m ct ca XbaI/SacI s dng trên vector pBI121.
Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3:NAC2
Sau phn ng ghép ni, vector tái t hp pRTRA7/3:NAC2
c kim tra bng phn  -     
NAC2NcoI/NAC2NotI và bng phn ng ct bi enzyme NcoI/NotI.
Hình nh n di sn phm ct trên hình 3.12-A cho thy kt
16

qu         c khong 1,1kb và
ng v c ca gen NAC2 (nn c-
myc và KDEL) và vector pRTRA7/3ng thi thc hin
phn -NAC2NcoI/NAC2NotI,
kt qu trên hình 3.12-B cho thy, sn phn gen
ng vi tính toán theo lý thuyt (1,1kp).
Hình 3.12. Kt qu n di trên gel agarose 1% (t vector
pTRA7/3:NAC2)

chng CV58 bn
 kim tra hong ca ct k trong cây trng
o nguyên liu chun b cho quá trình chuyn gen to cây
trng chu hn, cu trúc pBI121:NAC2 c bin np vào vi khun
A.tumefaciens chng CV58 bn. Thc hin
A
B
18

phn ng PCR vi cp mc hiu NAC2XbaI/NAC2SacI. Kt qu
n di sn phc th hin trên hình 3.17 cho thy,
c 8 dòng khun lu cho kt qu 
u này chng t n np vector
pBI121:NAC2 vào t bào A.tumefaciens chng CV58 thành công và
t hiu qu cao. Chuyn cu trúc gen mã hóa nhân t phiên mã NAC2 vào cây
thuc lá thông qua vi khun A.tumefaciens CV58
Các dòng thuc lá chuyn gen sau mt khong thi gian nht
nh sng sót ngoài t c chúng tôi kim tra bng phn
ng PCR vi cp mc hiu NAC2XbaI/NAC2SacI. Kt qu cho
thy, trong s 9 dòng thuc lá sàng lc ngu nhiên sau kiu
cho phn n di xut hic


Gen NAC2/c-myc/KDEL c khong 1,1kb, sau khi
dch mã, phân t protein s c  c tính toán theo lý thuyt
khong 39 kDa. Kt qu lai Western cho thy,  2 dòng thuc lá
chuyn gen N19 và N106 xut hin tín hiu lai có khng phân t
vào khong 39 kDa, còn dòng cây không chuyn gen không thy có
tín hiu lai (Hình 3.21). Kt qu thí nghim khnh, protein do
gen NAC2 u hin trong mt s dòng thuc lá chuyn
gen và ct k hong tt  thuc lá.
3.4. To dòng lc chuyn gen mang gen mã hóa NAC2
3.4.1. H thng tái sinh  cây lc
Sau mt tun nuôi ti, phôi trc cm ng to thành mt khi
mô sc kho
nht hoc trng xp. Sau 7 tun nuôi ngoài sáng ch các khi mô so
màu vàng, không nht mi có kh o cm phôi soma.
Kt qu tái sinh t cm phôi soma cho thy, khi b sung
ng SIM, t l mu to chi và s chi trung
  c là cao nht  c ba ging lc sau 7 tun nuôi cy.
Trong nhng n    u chúng tôi la chn IBA 0,3
mg/l là n thích hp nht cho vic to r cây lc. Giá th (1
t:1 tru hun:1 cát vàng) làm nguyên lic in vitro ra t
nhiên. Sau hai tun chúng tôi chuyt.
3.4.2. Chuyn gen ch th GUS thông qua vi khun A.tumefaciens
Hiu sut ca quá trình chuyn gen không ch ph thuc vào
h thng tái sinh mà còn ph thuc vào rt nhiu yu t
m di truyn ca ging. Mt s nghiên cu chuyn gen thành
công vào cây lc thông qua mô sc công b. Chúng tôi
la chn ging l tin hành thí nghim chuyn gen ch th
21


so ging lc LVT thông qua vi khun A. tumefaciens

Quá trình chuyc tin hành trên 4 lô thí nghim vi
tng s 935 mc s dng cho chuyn gen, có 595 mu to phôi
23

soma, 1416 chi hình thành, trong quá trình chn lc kháng sinh có
189 cây sng sót trên giá th và trng  nhà i.
Hình 3.26. Hình nh chuyn cu trúc mang gen mã hóa nhân t
phiên mã NAC2 qua A. tumefaciens và h thng tái sinh phôi soma
ng nuôi cy vi vi khun A. tumefaciens; B. Phôi soma chuyn
gen sau 7 tun; C. Cm chi t phôi soma chuyn gen trên môi
ng chn lc; D. Chi chuyng chn lc; E.
Cây lc chuyng ra r; F. Cây lc chuyn gen trên
giá th t:tru:cát.
 kim tra s có mt ca gen chuyn, sau khi ra cây khong
1 tháng, mu lá cc ti tách chit
DNA tng s.
S dng DNA tng s t, chúng tôi tin hành phn
ng PCR vi cp mc hiu NAC2XbaI/NAC2SacI. Kt qu n
di sn phm PCR cho thc 4 i phn
ng PCR chim t l 0,43 % s mu bin np (dòng 24, 49, 52, 89 
hình 3.25). c tip tc tr thu h
s biu hin ca gen chuyn  các th h sau.
24



1. Các ging lc nghiên cc xp thành 3 nhóm khác nhau
v m chu hn  n mô so và cây non. Hai ging L12,

NGUYN TH THU NGÀ

NGHIÊN CU PHÂN LP VÀ CHUYN GEN NAC2 LIÊN
N TÍNH CHU HN  CÂY LC
(Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyn hc
Mã s: 62 42 01 21
TÓM TT LUN ÁN TIC

Thái Nguyên  2013