MỞ ĐẦU
 Lý do chọn đề tài
Chitosan (CTS) là polysacaric có nguồn gốc tự nhiên, được tách chiết từ vỏ
các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, CTS được ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh
vực khác nhau. Trong y dược, CTS được dùng để sản xuất glucosamin, một dược
chất dùng để chữa bệnh khớp đang phải nhập khẩu ở nước ta. Trong công nghiệp,
CTS được dùng để chế tạo nhiều sản phẩm có giá trị cao như: vải CTS dùng trong y
tế, vải chịu nhiệt, vải chống thấm. Ngoài ra CTS còn dùng để sản xuất sơn chống
thấm và mốc. Trong nông nghiệp, CTS được sử dụng để bảo quản quả, hạt giống
mang lại hiệu quả cao, dùng làm vacxin thực vật, thuốc kích thích sinh trưởng.
Trong công nghệ in ấn, CTS được ứng dụng làm mực in cao cấp, tăng cường độ
bám dính của mực in. Trong công nghệ môi trường, CTS được ứng dụng trong xử
lý nước thải công nghiệp. Trong công nghệ sinh học, CTS được dùng làm chất
mang cố định enzyme và cố định tế bào. Trong công nghệ thực phẩm, CTS được sử
dụng để sản xuất ra màng mỏng để bao gói thực phẩm… [12].
Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào, chiếm một
lượng lớn tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản. Hằng năm, các nhà máy chế biến đã
thải bỏ một lượng lớn phế liệu giáp xác. Chính vì vậy nguyên liệu ban đầu để sản
xuất CTS luôn sẵn có và rất rẻ.
Với mục đích tận dụng được lượng phế thải rắn là vỏ tôm trong ngành chế
biến thủy sản để sản xuất CTS có chú ý đến một số tiêu chuẩn thương mại, chúng
tôi chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu chế tạo chitosan từ vỏ tôm đạt một số
tiêu chuẩn thương mại” làm khóa luận tốt nghiệp.
 Mục đích nghiên cứu
Chế tạo chitosan đạt một số tiêu chuẩn thương mại từ vỏ tôm.
 Đối tượng nghiên cứu
Chitin, CTS có trong vỏ tôm.
 Phạm vi nghiên cứu
Chế tạo chitosan từ vỏ tôm đạt một số tiêu chuẩn thương mại.
 Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu lý thuyết

H
13
O
5
N)
n

Phân tử khối: M
chitin
= (203,09)
n
O
OH
OH
O
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
NHCOCH
3
O
OH
O

6
H
11
O
4
N]
n
Phân tử khối: M
chitosan
= (161,07)
n
CTS là polymer sinh học tự phân hủy, có cấu tạo gồm các đơn vị
D – glucosamine và N – acetyl – D – glucosamine liên kết với nhau qua cầu nối
β (1–4) glycosit như hình 1.5.
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của chitosan
- Liên kết β – glycosit mỗi mắt xích lệch nhau một góc 180
0
tạo lên mạch xoắn.
- Tương tác Vander Wall (d = 0,3 – 0,6μm).
- Khi khoảng cách giữa các mắt xích quá nhỏ (0,3µm) giữa chúng xuất hiện liên kết
hydro, do tương tác giữa nhóm –OH, –NH
2
trong phân tử.
Hình 1.5 mô tả cấu trúc CTS trên lý thuyết. Thực tế, mạch phân tử CTS vẫn
tồn tại nhóm axetyl đan xen do sự deaxetyl hóa chưa hoàn toàn. Do vậy, công thức
cấu tạo chính xác của mạch CTS có thể biểu diễn như hình 1.6.

Hình 1.6. Công thức cấu tạo chính xác của CTS
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý của chitin

Chitin tan trong một số dung môi hữu cơ có chứa clorua liti như:
N, N – dimetylacetamid (DMAc) chứa 5% LiCl, N – etyl pyrrolydon – LiCl, Khả
năng hòa tan của chitin trong DMAc – LiCl phụ thuộc vào độ deacetyl của mẫu,
khả năng này giảm khi độ deaxetyl hóa tăng lên. Chitin cũng có thể bị phân tán
trong dung dịch chiocyanat liti đặc nóng và được tái kết tủa bằng sự pha loãng với
nước, ancol hoặc aceton. Cấu trúc cứng của chitin sẽ bị phá hủy một cách từ từ do
sự hình thành phức giữa ion canxi và nhóm acetamid ở vị trí C
2
của N – acetyl

glucosamin, làm cho hệ dung môi bao gồm CaCl
2
.2H
2
O – MeOH trở thành hệ
dung môi khá tốt cho việc hòa tan chitin.
Khác với cellulose, chitin tan chậm trong dung dịch hypochloride ở nhiệt độ
phòng, nhưng không tan trong dung dịch Scheweitzer [Cu(NH
3
)
4
](OH)
2
. Chitin tan
trong dung dịch của natri trong amoniac lỏng để cho ra hợp chất đơn natri.
Tính tan của chitin ảnh hưởng đáng kể đến khả năng ứng dụng của nó. Do
đó, nghiên cứu biến tính chitin tạo ra các dẫn xuất khác nhau có khả năng hòa tan
trong các dung môi thông thường gần đây được tập trung chú ý nhằm nâng cao hiệu
quả sử dụng của loại polysaccharide thiên nhiên quý giá này.
 Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý của CTS

ĐĐA
75% 87% 96%
Độ nhớt (cP) 111,2 103,4 107,3
Tính thấm nước (%) 659 472 486
Độ tan (%) 99,4 99,6 99,5
 Tính chất hóa học
 Tính chất hóa học của chitin
Chitin có tính chất của ancol, amin và amit vì trong phân tử có các nhóm
chức –OH, –NHCOCH
3
trong các mắt xích N – axetyl – D – glucosamine và
nhóm –OH, –NH
2
trong các mắt xích D – glucosamine. Phản ứng hóa học có thể
xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O
-
; dẫn xuất thế N
-
; hoặc dẫn xuất thế
O
-
, N
-
.
Mặt khác, các liên kết β (1–4) glycosit giữa các monome trong chitin rất dễ bị
cắt đứt bởi các chất hóa học như axit, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzym thủy phân.
Phân tử chitin có thể được kí hiệu tượng trưng như sau:
a. Phản ứng Van-Wisseleigh
Chitin, CTS phản ứng với dung dịch I
2

phương pháp cắt mạch chủ yếu sau:
- Cắt mạch bằng các enzym như chitosanase, papain.
- Cắt mạch bằng tác nhân hóa học: H
2
O
2
, các peraxit, HCl, NaNO
2
/H
+

- Cắt mạch bằng chiếu xạ: gamma Co–60, siêu âm, chùm electron.
d. Các phản ứng tạo dẫn xuất
Tùy thuộc tác nhân phản ứng vào nhóm chức –NH
2
, –OH hay cả 2 nhóm
chức để tạo dẫn xuất khác nhau:
- Phản ứng vào nhóm chức –OH
Đối với chitin, phản ứng thường xảy ra với các nhóm –OH vì nhóm –
NHCOCH
3
tương đối kém hoạt động.


→
+
H




Chit – O – SO
3
NC
5
H
6
 →
NaCl
Chit –
SO
3
Na
- Các phản ứng vào nhóm –NH
2
Chit – NH
2
+ HOOC – CH
3
→ Chit – NH
3
+
+ CH
3
COO
-
Chit – NH
2
+ Cl – CH
2
– COOH → Chit – NH – CH

3
COOH)
x
$
e. Phản ứng este hóa:
Chitin tác dụng với axit nitric đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat.
Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N, N – dimetyl
anilin cho sản phẩm chitin sunfonat.
 Tính chất hóa học của CTS
CTS là một polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết
β (1–4) glycosit. Các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: axit,
bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân. Mỗi mắt xích phân tử của CTS có
3 loại nhóm chức có khả năng phản ứng để tạo ra các dẫn xuất khác nhau của CTS.
Phản ứng với axit glyconic của nhóm –NH
2
Chit – NH
2
+ OHC – COOH → Chit – N = CHCOOH + H
2
O
Phản ứng với halogen axit như axit monocloroaxetic tạo dẫn xuất
N – carboxylmethyl CTS theo phản ứng
Chit – NH
2
+ Cl – CH
2
COOH → Chit – NH – CH
2
– COOH + HCl
Phản ứng với alhydride axit tạo dẫn xuất N-acyl CTS

- Sự hiện diện của nhóm amin tự do trong đơn vị D – glucosamine có thể
được proton hóa trong môi trường axit làm cho CTS có thể hòa tan được trong môi
trường axit loãng, tạo thành dung dịch có pH khoảng 4,0 ÷ 6,4.
Phản ứng với axit đậm đặc tạo muối khó tan
Phản ứng với dung dịch I
2
/KI trong môi trường H
2
SO
4
cho màu tím. Đây là
phản ứng dùng để định tính CTS.
 Ứng dụng của CTS
1.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm

Chit
-CH
2
OH -CH
2
OR
-OH +5RX → Chit -OR + 4HX + X
-
-NH
2
-N
(+)
R
3
CTS là một polyme dùng an toàn cho người và có hoạt tính sinh học đa dạng.

hồi bằng CTS có thể được tận dụng làm thức ăn gia súc vì CTS an toàn và protein
thu được có chất lượng tốt, chứa đủ các axit amin cần thiết.
1.5.4. Trong y học và công nghệ sinh học

CTS và dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rãi trong y học và công nghệ
sinh học nhờ các tính chất quan trọng như tương thích sinh học cao, tự phân hủy
sinh học, khả năng tạo màng, không độc, có khả năng làm lành vết thương, kháng
khuẩn, kháng nấm,…
a)
Glucosamine
b) Băng cầm máu
Hình 1.8. Chitosan sử dụng trong y học
CTS được dùng làm chất tạo màng, tạo dính để tạo viên nang bao bọc thuốc
hoặc làm tá dược hay các chất mang sinh học dẫn thuốc. Ở một số nước đã sản xuất
chỉ phẩu thuật tự hoại bằng chitosan, thuốc đau khớp từ glucosamin và một số sản
phẩm thủy phân từ chitosan.
Trong công nghệ sinh học, chitosan có nhiều tác dụng đa dạng như: có khả
năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại
khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế
bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Chitosan không những ức chế các vi khuẩn
gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của
chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối
lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực
phẩm.
 Điều chế chitosan
Công nghệ sản xuất chitosan dựa trên nguyên tắc loại bỏ muối calcium,
protein và các chất màu, lipid có trong vỏ tôm, cua, ghẹ…
Việc khử các tạp chất để sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản có thể thực hiện
bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hoặc kết hợp hai phương pháp.
Hiện nay các quy trình sản xuất chitin quy mô lớn chủ yếu sử dụng phương pháp hóa

Bảng 1.3. Thành phần cơ bản của vỏ tôm thẻ chân trắng
Thành phần hóa học Hàm lượng* (%)
Chitin 29,4 ± 1,4
Hàm lượng protein 24,3 ± 1,2
Hàm lượng khoáng 26,5 ± 1,9
Hàm lượng lipit 2,2 ± 0,5
1.6.2. Khử khoáng
Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO
3
và rất ít
Ca
3
(PO
4
)
2
. Để khử khoáng người ta thường dùng các loại axit như HCl, H
2
SO
4
,
Quá trình khử khoáng thường được thực hiện ở nhiệt độ thường kết hợp với khuấy
đảo. Chất lượng chitin thu được phụ thuộc nồng độ của axit, thời gian ngâm và tỷ lệ
khối lượng trên thể tích (w/v) của quá trình khử khoáng. Thông thường, nồng độ
HCl được sử dụng đối với phế liệu tôm thấp hơn so với phế liệu cua, ghẹ. Vì vậy,
tùy theo từng loại nguyên liệu và yêu cầu chất lượng chitin mà thực hiện chế độ khử
khoáng sao cho phù hợp [14].
1.6.3. Đề protein
Quá trình khử protein từ phế liệu thủy sản có thể thực hiện với nhiều hóa
chất


CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất
- Vỏ tôm được thu mua tại các nhà hàng, quán ăn trên địa bàn quận Gò Vấp,
Tp. Hồ Chí Minh.
- HCl dạng tinh khiết của Trung Quốc
- NaOH dạng tinh khiết của Trung Quốc
- H
2
O
2
dạng tinh khiết của Merck, Đức.
- Nước cất được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm
2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
- Máy sắc ký gel thấm qua (GPC) LC-20AB Shimadzu, Nhật, sử dụng
detector RID - 10A và cột Utrahydrogel 250 của hãng Waters, Mỹ, tại Trung tâm
Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM; Viện Năng lượng nguyên
tử Việt Nam.
- Máy nghiền bi Fritsch, Đức, tại Trung tâm VINAGAMMA, Tp. HCM
- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT - IR 8400s, Shimadzu, Nhật, tại Trung
tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, Tp. HCM.
- Một số trang thiết bị khác dùng cho thí nghiệm như cân phân tích, tủ sấy, lò
nung, bình hút ẩm, tại Phòng thí nghiệm Hóa học trường Đại học Sài Gòn.
2.2.2. Dụng cụ
Các dụng cụ chịu nhiệt như cốc thủy tinh, cốc sứ và một số dụng cụ khác tại
Phòng thí nghiệm Hóa học trường Đại học Sài Gòn.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp chiết tách chitin từ vỏ tôm
Nguyên liệu: Vỏ tôm sau khi thu mua về được loại bỏ chân, râu, đuôi và tạp

5%6
$5$$$
:;<5;$
4
5%6
!(78/9!%
:;<5;$
=&>!
Hình 2.1. Hai quy trình chiết tách chitin từ vỏ tôm
Khử khoáng: Vỏ tôm được ngâm trong dung dịch HCl 5% theo tỉ lệ 1:10 (w/v)
khoảng 2 giờ, ở nhiệt độ phòng, thực hiện khuấy đảo để phản ứng xảy ra đồng đều
hơn. Sau khi khử khoáng sản phẩm được rửa trung tính đến pH = 7.
Đề protein: Sản phẩm sau khi khử khoáng được ngâm trong dung dịch
NaOH 5% với tỷ lệ w/v = 1/10 và cho lên bếp điện, ổn định nhiệt độ ở 100
o
C,
khuấy liên tục. Sau khi đề protein, tiến hành rửa sản phẩm đến pH = 7, ngâm trong
nước cất qua đêm, sau đó rửa lại đến pH = 7.
Tẩy màu: Quá trình tẩy màu sử dụng H
2
O
2
0,1% với tỉ lệ w/v = 1/10 trong 30
phút. Sau đó rửa sạch và để khô tự nhiên. Sấy mẫu ở nhiệt độ 60 – 70
o
C trong thời
gian là 2 giờ.

2.3.2. Phương pháp chế tạo chitosan
Chitin được làm ẩm 10% bằng nước cất. Sau đó cho vào dung dịch NaOH

1320
, A
1420
là mật độ quang tương ứng tại các số sóng 1320, 1420 cm
-1
.

Hình 2.2. Mẫu màng CTS/KBr sau khi ép viên
Hình 2.3. Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR 8400S (Shimadzu, Nhật)
b. Xác định KLPT CTS
Phương pháp sắc ký gel thấm qua (Gel Permeation Chramatography – GPC)
xác định KLPT trung bình khối lượng (M
w
) và KLPT trung bình số lượng (M
n
) là
phương pháp thường được dùng để xác định KLPT polyme và chỉ số đa phân tán
(Polydispersity Index – PI) của polyme bao gồm cả CTS.
Hình 2.4. Máy sắc ký gel thấm qua (GPC) LC – 20 Shimadzu, Nhật
$
Các bước xác định khối lượng phân tử CTS được đo bằng GPC:
- Bước 1: Lập đường chuẩn thời gian lưu và KLPT của mẫu chuẩn Pullulan
Hòa tan 0,01 gam các mẫu chuẩn Pullulan có KLPT là 738 – 380 000 Da
(bảng 2.1) vào trong 2ml dung môi CH
3
COOH 0,25M /CH
3
COONa 0,25M. Xác
định thời gian lưu của các mẫu dung dịch Pullulan trên máy LC – 20AB, Shimadzu,
detector RID – 10A, sử dụng cột Utrahydrogel 250, 500 và Linear của hãng Waters,

Chuan pulullan, Sigma USA COT VINAGAMMA
Linear : ax+b
a = – 0.7531064 b = 13.07259
R^2 = 0.9792989 R = 0.9895953 Dispersion = 0.1213883
Bảng 2.3. KLPT và thời gian lưu của các mẫu chuẩn Pullulan đối với cột
Utrahydrogel 250
Số thứ tự mẫu 1 2 3 4 5
Thời gian lưu, Phút 7,00 7,50 8,12 8,64 10,52
KLPT × 10
3
, Da
100 48 23,7 12,2 0,738

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
-5
0
5
10
15
20
uRIU
Detector B Ch1
Hình 2.6. Đường chuẩn tương quan giữa KLPT và thời gian lưu của
Pullulan đối với cột Utrahydrogel 250
Linear : ax+b a = – 0.6024559 b = 9.236203
R^2 = 0.9975414 R = 0.9987699 Dispersion = 0.0363634
0.0 2.5 5. 0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
-5
0
5

40
uRIU
Detector B
Hình 2.7. Sắc kí đồ GPC thời gian lưu của mẫu chuẩn Pullulan ghi trên cột
Ultrahydrogel 250 với KLPT a) 100 000, b) 40 000 c) 23 720 d) 12 200 và e) 738
- Bước 2: Xác định KLPT của mẫu CTS
Hòa tan CTS vào dung dịch đệm CH
3
COOH 0,25M/ CH
3
COONa 0,25M cho
đến khi tan hoàn toàn, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm (Millipore filters). Tiêm
khoảng 50μl mẫu dung dịch CTS vào cột sắc ký. Các điều kiện khác tương tự
như đã mô tả đối với mẫu chuẩn pullulan. Xác định thời gian lưu và so sánh với
đường chuẩn để xác định KLPT của mẫu CTS cần đo.

c
d
e
f
Hình 2.8. Sắc kí đồ thời gian lưu của mẫu Chitosan KLPT thấp (f), CTS KLPT thấp
(g) và CTS KLPT cao (h)
Bảng 2.4. Kết quả M
w
của CTS đo bằng GPC
Thời gian lưu, phút
6,957
6,068
Bảng 2.4 đưa ra kết quả điển hình xác định KLPT đối với các mẫu là
chitosan KLPT thấp và cao.