Phần I: Đặt vấn đề
Nitơ hay còn gọi là đạm là một trong những nguyên tố đợc ngời ta quan tâm
nhiều nhất từ trớc tới nay. Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin. Nitơ còn là một thành
phần quan trọng của axit Nuclêic. Không có nitơ thì không có sự sống. Nitơ có mặt
trong chất diệp lục, trong nhiều loại vitamin, nhiều loại kích tố và rất nhiều hoạt chất
quan trọng khác.
Ngời ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta,cây trồng
cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ. Số lợng nitơ này nằm trong hạt và trong rơm rạ
hoặc trong thân lá. Hiệu suất sử dụng phân hóa học là vào khoảng 75%. Nh vậy có
nghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn có 5 tấn hạt chúng ta
phải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng với 833kg amôn sunphát) Số l-
ợng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn ngay cả ở nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học
phát triển
Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí có đến 78,16% là nitơ. Ngời ta
tính rằng bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x10
15
tấn nitơ, khoảng không khí bên
trên mỗi km
2
đất đai có khoảng 80.000 tấn nitơ. Số lợng nitơ này để thoả mãn nhu cầu
về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó(với thu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80
triệu năm.
Trong thực tế cây trồng( cũng nh ngời và động vật) không có khả năng đồng hoá
trực tiếp nguồn nitơ lớn lao này. Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí, phân tử nitơ tồn
tại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dây nối rất bền vững(N=N).
[3]
Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu tấn nitơ,
trong khi đó phân đạm hoá học của tất cả các nớc trên thế giới chỉ bổ sung đợc khoảng
30% số lợng nitơ bị lấy đi.
Trong khi con ngời muốn phá vỡ 3 liên kết trong phân tử nitơ (N=N)để dễ tạo ra
các loại phân hoá học, cần phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất phức tạp: nhiệt

Mục tiêu đề tài
1.Tìm ra các chủng Clostridium có khả năng cố định nitơ tự do
2.Chọn một chủng có khả năng cố định nitơ tự do lớn nhất để nghiên cứu đặc
điểm hình thái và các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH, tìm ra các trị
số tối u để chủng đó sinh trởng và phát triển tốt .
3.Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thực hành, thí nghiệm, phơng pháp
nghiên cứu khoa học.
Phần II: Tổng luận
I. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất:
Khu hệ vi sinh vật đất rất phức tạp, có những đặc điểm sinh lý và sinh thái rất
khác nhau. Riêng vi khuẩn đã rất phong phú. Chúng bao gồm vi khuẩn háo khí, vi
khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vi khuẩn cố định đạm Vi
sinh vật sống thành quần thể, giữa loài này và loài khác có tác động qua lại lẫn nhau,
chúng là tác nhân chủ yếu của quá trình chuyển hoá vật chất trong đất.
Vi sinh vật có mặt trong tất cả các loài vật nhng ở chân đất có đầy đủ chất dinh
dỡng, kết cấu và thành phần cơ giới tốt, có độ ẩm và phản ứng môi trờng thích hợp thì ở
đấy vi sinh vật phát triển nhiều và phong phú về thành phần. Trên những chân đất khô
hạn, lầy thụt thì sự phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt và tạo thành một khu hệ vi
sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vật chịu chua, khu hệ vi sinh vật kị khí và vi hiếu khí,
khu hệ vi sinh vật phát triển trong môi trờng nhiều H
2
, CH
4

Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u thế. Các loài vi khuẩn sống tự do, có
khả năng cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum có nhiều trong đất
lúa. Hai loại này có đặc điểm khác nhau :Azotobacter đòi hỏi có ô xi phân tử, có phản
ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg và chất hữu cơ. Vì vậy trong đất
lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter còn vi khuẩn kị khí Clostridium
pasteurianum phân bố nhiều trong đất lúa, số lợng của chúng có nhiều trong mỗi gam

1,3à.x1,6.à.
Hiên nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn nhận thấynhiều loài
Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử. đó là các loài: C.butyricum, C.
butylicum, C. beijerinckia, C aceticum, C .multifermentans, C. Acetobutylicum, C.
felsineum, C. kluyveri, C. lactoacetafilum, C.madisonii. Sự khác nhau về các đặc điểm
hình thái và sinh lý giữa các loài này có thể đợc thấy rõ trong khoá phân loại của
Bergey(1965).
Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố định cao
hơn các loài Clostridium khác. Khi đồng hoá hết 1g thức ăn các bon, chúng thờng tích
luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ. Khả năng cố định nitơ của các loài trong chi Clostridium
còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Clostridium có khả năng đồng hoá các
monosaccarit, disaccarit và một số polisaccarit(nh tinh bột, dextrin). Chúng có thể đồng
à
hoá cả nhiều rợu bậc cao và một số hợp chất chứa các bon khác nữa. Khi lên men
hidratcacbon, Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu cơ butanol, etanol, axeton, CO
2
,
H
2
Thành phần và tỷ lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn
cũng nh phụ thuộc vào hai pha khác nhau của quá trình lên men. Chẳng hạn
Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ trong pha đầu axit axetic, axitbutiric và
trong pha sau butanol, axeton và etanol.
Clostridium pasteurianum cũng nh nhiều loài Clostridium có khả năng cố đinh
nitơ khác có thể phát triển đợc trong phạm vi pH khá rộng (pH =4,7-8,5). Tuỳ từng
nghiên cứu mà pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của Clostridium là 5,9-8,3,hay
6,9-7,3. Các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết ngay cả những vùng đất chua, khi không
tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt với số lợng đáng kể.
Nói chung trên mỗi gam đất trồng lúa, trên miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm
này có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào. Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng

quá trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng giữa HNO
2
với axit amin hoặc
amit). Sau quá trình phản nitrat hoá, nitrat sẽ chuyển thành nitơ phân tử bay vào không
khí.
Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ
một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ, tức là quá trình chuyển hoá
nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá
trình này đợc gọi là các vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác dụng làm giàu thêm
nguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất.
Hình 1: Chu trình nitơ trong tự nhiên
IV. Cơ chế của quá trình cố định Nitơ phân tử
Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N
2
thành các dạng
hợp chất của nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều năng lợng. Số năng lợng
để tổng hợp một tấn NH
3
tơng đơng với số năng lợng sinh ra khi đốt cháy 5 tấn than
đá. Trong khi đó các vi sinh vật cố định nitơ bằng một cơ chế nào đó đã thờng xuyên
chuyển hoá đợc N
2
thành các hợp chất chứa nitơ ngay trong điều kiện bình thờng về
áp suất và nhiệt độ. Nếu khám phá ra đợc cơ chế quá trình cố định nitơ ở vi sinh vật
n
2
2
n o
2
no

Thực vật
thì rõ ràng sẽ mở ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ quá
trình sản xuất phân nitơ hoá học.
Đa số nghiên cứu đều cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá
trình khử N
2
thành NH
3
dới tác dụng của men nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật.
Nitrogenaza có thể thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào của các vi sinh
vật cố định nitơ .
Nitrogenaza là một hệ phức enzim. Chúng cấu tạo bởi 2 thành phần đó là
prôtêin có phân tử nhỏ.
Một thành phần gọi là prôtêin sắt còn gọi là nitrogenaza khử hay thành phần
II. Một thành phần khác gọi là prôtêin sắt-Molipden hay còn gọi là thành phần I.
Thành phần II đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm 2 tiểu phần
đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lơng 29.000, ở giữa có một trung tâm chứa 4
nguyên tử Fe và 4 nguyên tử S không ổn định với axit. Thành phần I(Mo-Fe prôtêin )
ở Clostridium pasteurianum phức tạp hơn có khối lợng phân tử chung là 220.000
gồm 2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe và nhiều nguyên tử S không ổn định
với axit. Chúng có cấu tạo bởi 4 tiểu phần gồm 2 loại, mỗi loại có khối lợng phân tử
là 50 và một loại có khối lợng phân tử là 60.000 Dalton. Mỗi loại gồm hai tiểu phần.
Nitrogenaza không chỉ xúc tác việc khử N
2
thành NH
3
mà còn có thể xúc tác
việc khử CH
3
CN, HCN, NH

N2 [NH = NH]

[NH
2
-NH
2
] 2NH
3
Sơ đồ giả thuyết về trung tâm hoạt động của nitrogenaza đợc trình bày nh sau:
Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa Fe của
thành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần en zim I(prôtêin
-Fe-Mo).Electron đã hoạt hoásẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo ở bên trong
"hạt. Tại đây Mo sẽ bị khử và nhờ đó có khả năng phẳn ứng nhanh chóng với N2.
Phân tử N
2
đi qua một khe có kích thớc khoảng 4-5 A
o
tức là tơng ứng với chiều dài
của phân tử N
2
vào bên trong men và đợc hoạt hoá ở đấy.
Kết quả của quá trình Nitrogen hoạt hoá và hấp phụ hoá học Nitơ sẽ làm dứt 2
dây nối trong số dây của phân tử N
2
. Năng lợng tiêu phí là 7,8x10
5
J/mol. Dây nối thứ
3 sẽ cắt đứt khi tiếp xúc với hidro đã đợc hoạt hoá nhờ các men đehirogenaza và hệ
thống hidrogenaza.
Sau đó NH

nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất đã khử trùng) để bón cho cây trồng. Trong
một số trờng hợp đã thu đợc những hiệu quả dơng tính khá rõ rệt(nhất là khi phối hợp
với Azotobacterin ). Tuy nhiên hiệu quả nay thờng không ổn định và cho đến nay ng-
ời ta vẫn cha giải thích đợc một cách dứt khoát là trong trờng hợp có tác động dơng
tính thì chủ yếu là do sự cố định nitơ hoặc là do tích luỹ những chất có hoạt tính sinh
học cao.[3]
Phần III: Địa điểm, thời gian và phơng pháp nghiên
cứu
I. Địa điểm nghiên cứu:
Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trờng Đại học Vinh
II. Thời gian nghiên cứu:
Từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 4 năm 2007
III. Phơng pháp nghiên cứu
3.1 Phơng pháp điều tra
Dùng phiếu điều tra để tra khảo tình hình sản xuất kết hợp vói phỏng vấn các hộ
đển hình về chế độ đầu t ,phân bón những nhận xét về đất trồng ,kỹ thuật canh tác
3.2. Thu mẫu vi sinh vật
Khi phân lập vi sinh vật từ đất hay tính số lợng vi sinh vật của đất thì việc lấy
mẫu đợc tiến hành nh sau:
Dùng dao vô trùng lấy 1 kg đất ở độ sâu 0-30cm thuộc 5 chỗ khác nhau theo
phơng pháp đờng chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đã khử trùng để đựng
đất, loại bỏ rễ cây và vật lạ. Ghi nhãn, bảo quản và phân tích tại phòng thí nghiệm.
[10]
3.3. Phơng pháp phân lập vi sinh vật
Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki gồm:
(NH4)2SO4 2g
Cân 1 kg đất đã đồng đều +10ml n
ớc cất (vô trùng)
Lắc 10-15 phút
Để lắng

trờng thạch nghiêng hoăc môi trờng lỏng ,cấy ríc rắc vuông góc lên mặt thạch
của hộp petri.Sau đó chọn khuẩn lạc mọc tốt của vi sinh vật cần tìm đem cấy vào ống
nghiệm chứa môi trờng lỏng .[7]
3.4. Phơng pháp theo dõi (theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển)
3.4.1.Thời gian mọc của vi khuẩn
Sau khi cấy dịch huyền phù vào môi trờng thạch, theo dõi thờng xuyên sự xuất
hiện của khuẩn lạc cho đến khi không xuất hiện các khuẩn lạc mới. Vì mỗi loài có có
một tốc độ sinh trởng và phát triển không giống nhau.
3.4.2.Theo dõi sự sinh trởng:
Nuôi trong đĩa petri, đo kích thớc (() của khuẩn lạc bằng thớc đo palmer trong
thời gian 24 giờ hoặc 48 giờ hoặc 72 giờ.
Từ đó tốc độ sinh trởng theo Blachman(1981)
Wt-Wo
P= x100%
Wo
Trong đó: Wo là số đo lần đầu
Wt là số đo lần sau tại thời điểm t
3.4.3.Tìm hiểu các đặc điểm của các khuẩn lạc
Vi sinh vật phát triển trên môi trờng đặc sẽ hình thành các khẩn lạc đặc trng cho
loài đó. Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các công việc rất cần thiết đối
với công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu.
Tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc: Màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấu trúc, bờ
khuẩn lạc.
3.4.4. Thử hoạt tính cố định nitơ của các chủng
+Thử định tính
Từ các chủng đã phân lập đợc, dùng que cấy lấy một ít chủng cho vào ống
nghiệm chứa 2 ml nớc cất. Sau đó cho thuốc thử Nessle vào:
Xuất hiện màu vàng cam(dơng tính :+)
Không xuất hiện màu vàng cam(âm tính:-)
+Thử định lợng(amôn)

i
Vf
i
Trong đó: A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1
ml mẫu.

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa đã chọn
(25-250 khuẩn lạc) theo FDA(Food and Drug Asministration )
n
i
: Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml)cấy vào trong mỗi đĩa
f
i
: Độ pha loãng tơng ứng.[14]
3.6. Các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng
3.6.1. ảnh hởng của độ ẩm
Đất mới lấy về làm sạch bằng cách sấy khô.Dùng nớc cất vô đạm cho vào, điều
chỉnh độ ẩm
Xác định độ ẩm của đất bằng máy Humiditi/Thermometer.HANA. Hig 161C
của Anh
Xác định hàm lợng NH
+
4
ở độ ẩm khác nhau trong các ngày khác nhau.
- Phơng pháp xác định NH
+
4
theo Kjendahl Nessler và Sapiro-1972.[12]
Cân 10 g đất tơi +100ml KCl 0,1N cho voà bình tam giác 250ml dịch lọc vào bình

màu.
Tiến hành so màu nh mẫu nghiên cứu.
3.6.2. ảnh hởng pH
Cho mỗi công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật nh nhau cùng một môi trờng đã
vô trùng, điều chỉnh pH ở các công thức khác nhau (pH=5, pH=6, pH=7, pH=8, pH=9).
Sau đó nuôi cùng một nhiệt độ là 30
0
C.
Từ đó xác định hàm lợng NH
+
4
ở các công thức bằng phơng pháp so màu với
thuốc thử Nessle.
3.6.3. ảnh hởng nhiệt độ.
Để theo dõi ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng đồng hoá của nitơ ta cho mỗi
công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật vào cùng một môi trờng. Sau đó đem nuôi các
điều kiện nhiệt độ khác nhau 20
0
C, 30
0
C, 40
0
C, 50
0
C.
Xác định NH
+
4
ở các công thức bằng phơng pháp so màu với thuốc thử Nessle.
3.6.4. ảnh hởng thời gian đến khả năng đồng hoá Nitơ

i 1
X X
n
=

=

Phần IV: Kết quả nghiên cứu
Chơng I: Đặc điểm của vi khuẩn clostridium
I. Tình hình sản xuất ở địa phơng
1. Địa điểm:
Đất trồng lạc - xóm 17 - Nghi Liên - Nghi Lộc - Nghệ An
2. Loại đất:
Là đất trồng lạc truyền thống , kết hợp với luân canh lạc -ngô -vừng ,vụ chính từ
tháng 12- tháng 4 âm lịch .
Địa hình bằng phẳng ,đất cát pha giữ ẩm kém ,pH trung tính
3. Diện tích: 500m
2
4. Kỹ thuật:
- Kỹ thuật làm đất: Làm 3 lần : Cày vỡ, cày trở, cày vọc, sau đó chia luống, mỗi
luống 1-1,5m
Bón phân: Phân chuồng 3 -4tạ phân/sào
Phân NPK 15-20kg/sào. Tỷ lệ N:P:K là 10:8:5
Bón vôi: 20 - 30kg/sào
Rắc tung phân sau đó tiến hành xới xáo để trộn đều phân vào đất
- Kỹ thuật trỉa lạc: Giống lạc L14, lạc Trung Quốc. Với kỹ thuật trồng lạc phủ ni
lông ,phun thuốc trừ cỏ
Mỗi mét chia 5 hàng, mỗi hàng cách 20 - 25cm, mỗi khóm(cây)cách 10 - 15cm.
- Kỹ thuật chăm sóc: Lạc khoảng 3 lá bón thêm đạm: 2kg/sào
Khi lạc 4-5 lá thì làm cỏ.

0
C.
2. Quy trình phân lập.
Để có các chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập theo quy trình sau:
Cân chính xác các thành phần của môi trờng
Đun sôi, điều chỉnh pH=7
Cho vào 1/3 bình tam giác
Cho vào petri
Cấy dịch đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau
Dùng trang thuỷ tinh trang đều
Nuôi ở tủ ấm 30
0
C trong 5-7 ngày
(Khi có các khuẩn lạc)
Quan sát và chụp ảnh

Trích đoạn ảnh hởng của nhiệt độ

---