BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
PHƯƠNG PHÁP CHÊ BIẾN ĐẾN TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA VỊ THUỐC THẢO QUYÊT MINH
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược
Người hướng dẫn: ThS.
TS. VŨ THỊ TRÂM
Noi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền
Bộ môn Dược lý
Thòi gian thực hiện: 3 - 5/2004
HÀ NỘI 5-2004
n è s C ẩM <&&
Để đạt được những kết quả trong quá trình nghiên cứu đề tài này,
tôi đã được các thầy, cô giáo hướng dẫn chỉ bảo nhiệt tình. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. Phùng Hoà Bình
ThS. Nguyễn Thế Hùng
TS. Vũ Thị Trâm
■
là những người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện
khoá luận tôt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cô kỹ thuật viên
bộ môn Dược lý, bộ môn Dược học cổ truyền, các bộ môn và phòng
ban trường đại học Dược Hà Nội đẵ tận tình hướng dẫn, giúp đõ tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Xin cảm ơn cha mẹ, người thân và bạn bè đã giúp đd động viên
tôi trong quá trình thực hiện đề tài./.
Hà Nội ngày 28 tháng 5 năm 2004
Sinh viên

S: mẫu sống.
SC: sao cháy.
SKĐ: sắc ký đồ.
SKLM: sắc ký lớp mỏng.
SV: sao vàng.
TB: trung bình.
TPHH: thành phần hoá học.
YHCT: y học cổ truyền.
ĐẶT VẤN ĐỂ
Theo y học cổ truyền, trước khi sử dụng các vị thuốc thường được chế
biến nhằm tăng tác dụng điều trị, giảm tác dụng không mong muốn và tăng độ
an toàn. Trong đó, hoả chế là một phương pháp chế biến thông dụng với nhiều
phương pháp khác nhau. Thực chất, hoả chế là sử dụng tác dụng của “nhiệt
khô” ở mức nhiệt độ khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau.
Trên thực tế, thành phẩm chế biến theo phương pháp hoả chế chủ yếu
được đánh giá bằng cảm quan: màu sắc, mùi vị. Vì vậy, chất lượng thuốc có
thể không ổn định. Ngoài ra, một số vị thuốc sống có màu sắc tối sẫm hơn
màu sắc của tiêu chuẩn thành phẩm được quy định cho từng phương pháp gây
khó khăn cho việc nhận biết cảm quan.
Trong những năm gần đây, kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho
thấy nhiệt độ có tác dụng mạnh đến thành phần hoá học của vị thuốc dẫn đến
sự thay đổi đáng kể tác dụng sinh học của vị thuốc.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của
phương pháp chê biến đến tác dụng sinh học của vị thuốc thảo quyết
minh”,với mục đích bước đầu xây dựng tiêu chuẩn về mức nhiệt độ và thời
gian sấy để chuẩn hoá việc chế biến thảo quyết minh tương đương với phương
pháp sao của y học cổ truyền.
Nội dung của đề tài:
♦> Khảo sát sự ảnh hưởng của các phương pháp sao sấy đến thành phần
anthranoid của vị thuốc.

Thực chất màu sắc của vị thuốc sau chế biến biểu hiện sự ảnh hưởng của nhiệt
khi chế biến ở các mức nhiệt khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau.
♦> Các phương pháp hoả chế
■ Sao:
- Sao trưc tiếp: là phương pháp sao mà nhiệt được truyền trực tiếp đến
vị thuốc.
Nhiệt độ sao:
Sao qua (vi sao): 50 - 80°c.
Sao vàng (hoàng sao): 100 - 140°c.
Sao vàng sém cạnh: 100 - 140°c.
Sao vàng hạ thổ: 100 - 140°c.
Sao đen (hắc sao): 180-240°c.
Sao cháy (thán sao): 180-240°c.
Tiêu chuẩn thành phẩm:
Sao qua: màu sắc của vị thuốc biến đổi không đáng kể so với dược liệu sống.
Sao vàng: sản phẩm bề mặt ngoài màu vàng hoặc vàng đậm, bên trong
có màu thuốc sống.
Sao vàng sém cạnh: sản phẩm có bề mặt ngoài màu vàng, rìa cạnh đen.
Sao vàng hạ thổ: màu sản phẩm như sao vàng.
Sao đen: bề mặt ngoài sản phẩm màu đen, bên trong màu vàng.
Sao cháy: bề mặt ngoài sản phẩm màu đen, bên trong màu nâu đen.
Mục đích:
Sao qua: tránh mối mọt, ổn định thành phần hoạt chất.
Sao vàng: tăng tác dụng qui tỳ, tăng mùi thơm.
Sao vàng sém cạnh: làm giảm mùi vị khó chịu của thuốc.
Sao vàng hạ thổ: điều hoà âm dương.
Sao đen: tăng tác dụng tiêu thực, làm giảm tính mãnh liệt của vị thuốc.
Sao cháy: có tác dụng cầm máu.
- Sao gián tiếp: là phương pháp sao mà vị thuốc được truyền nhiệt gián
tiếp qua phụ liệu trung gian như: cám gạo, cát, hoạt thạch, văn cáp.

Hàm lượng tanin trong ngũ bội tử khi sấy ở 80°c tăng 4% so với mẫu
sống [14].
- ở mức nhiệt độ 120 - 160°c hàm lượng các chất trong dược liệu thay
đổi đáng kể.
Lượng berberin trong hoàng liên sống là 7,82% khi sấy ở 160°c/10’ là
6,62% [19].
Tinh dầu là thành phần hoá học của vị thuốc bay hơi ở nhiệt độ thường.
Trong khoảng nhiệt độ 120 - 160°c, hàm lượng tinh dầu trong vị thuốc giảm
nhiều.
- ở mức nhiệt độ 170 - 240°C: hàm lượng các chất trong vị thuốc thay
đổi nhiều, nhiều sản phẩm bị phân huỷ, hàm lượng nhiều chất giảm đi, trong
khi đó có chất lại tăng lên.
Hàm lượng strychnin, brucin, strychnin N- oxyd trong mã tiền ở các
mẫu sống, 220°c, 260°c lần lượt như sau:
Strychnin: 16,70%, 1,55%, 0,585%.
Brucin: 1,317%, 1,318%, 0,463%.
Strychnin N - oxyd: 0,063%, 0,089%, 0,138% [17].
Hàm lượng tanin trong ngũ bội tử sấy ở 220°C/20', 30' giảm 30 - 50%
so với mẫu sống [14].
- Ở nhiệt độ từ 210-260°c nhiều saponin trong vị thuốc bị phân huỷ [23].
+ Saponin D (trong mộc thông): nhiệt độ nóng chảy > 225°c
+ Saponin E (trong mộc thông): nhiệt độ nóng chảy 210 - 214°c
+ Platycodin B (trong cát cánh): nhiệt độ nóng chảy 227 - 23l°c
Như vậy, nhiệt độ cao làm thay đổi nhiều về thành phần hoá học, thay
đổi về hàm lượng các chất trong vị thuốc. Sự biến đổi này phụ thuộc vào mức
nhiệt độ và khoảng thời gian chế biến vị thuốc.
1.1.4- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tác dụng sinh học của vị thuốc
Sự tác động của nhiệt ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau làm
biến đổi thành phần hoá học của vị thuốc về lượng cũng như về chất. Sự thay
đổi này làm thay đổi tác dụng sinh học của vị thuốc:

Otusin: R=OCH3, Rị= OCH3, R2= H.
Aurantio otusin: R= OH, Rj=OCH3, R2=H
Chrysoobutin: R=OCH3, Rị= OCH3, R2= CH3
- Trong hạt thảo quyết minh ở Việt nam có aloe emodin monoglucosid,
physcion diglucosid, chrysophanol diglucosid và triglucosid, chrysophanol
anthron. Ngoài ra còn có những chất không phải là dẫn chất anthranoid như:
rubrofusarin, nor-rubrofusarin, rubrofusarin-6-P-gentiobiosid, toralacton [1,26].
- Một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy, trong hạt thảo quyết
minh có tracchryson; một anthraquinon là alatemin; 2 naphtopyron glycosid
nor - rubrofusarin - 6 - Ị3 - D - glucosid, rubrofusarin - 6 - p - D - gentiobiosid;
một naphtalen glycosid là cassitorosid; P-sitosterol và một số anthranoid
không có hoạt tính sinh học. Hạt thảo quyết minh chưa già còn chứa
brassinolid, castasteron, typhasterol, teasteron, 28-norcastasteron,
monopalmatin và monoolein [26].
Ngoài ra, trong hạt còn có: chất nhầy, chất béo, sắc tố [1].
- Hạt thảo quyết minh chế biến theo YHCT có hàm lượng anthraquinon
thay đổi. Trước khi chế biến, anthraquinon toàn phần là 0,44%, anthraquinon
tự do là 0,08% và sau khi chế biến anthraquinon toàn phần là 0,18%,
anthraquinon tự do là 0,04% [26].
- Lá chứa một dẫn chất flavonoid là kaempferol-3-sophorosid [1].
- Vỏ thân và lá chứa 3, 5, 8, 3’, 4 \ 5’- hexa hydroxy flavon [26].
Hợp chất anthranoid có thể tồn tại dưới dạng oxy hoá (anthraquinon)
hoặc dạng khử (anthrol, anthron), dạng tự do (aglycol) hoặc dạng kết hợp. Các
anthranoid có màu từ vàng, vàng cam, đến đỏ gạch. Các hợp chất này dễ thăng
hoa nên có thể định tính bằng phản ứng vi thăng hoa anthranoid trên lam kính
rồi soi tinh thể qua kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng.
Các anthranoid không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ (ether,
ether dầu hỏa), NH3 (trừ acid chrysophanic).
Dưới dạng oxy hoá (anthraquinon) hoặc dạng khử (anthrol, anthranol),
quá trình chuyển dạng được thể hiện như sau:

kinh mạnh hơn dạng sống [21].
- Tác dụng ức chế vi khuẩn: 13 hợp chất phenolic glycosid bao gồm 6
hợp chất mới được tách ra từ hạt thảo quyết minh, trong số đó có
torachrysone, toralactone, aloemodin, rhein và emodin có tác dụng ức chế
Staphylococcus aureus đã kháng Methicillin. Tuy nhiên, các hợp chất
phenolic này không có tác dụng mạnh đối với Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa [31]. Ngoài ra, nước chiết hạt thảo quyết minh có tác dụng ức chế
vi khuẩn ngoài da, tác dụng này do chrysophanol gây nên (đối với vi khuẩn
gây ngứa và nổi ban đỏ) [15, 16].
- Tác dụng trên benzo [a] pyrene- trung gian ADN gây hại đối với tế
bào Hep G2: cao chiết nước từ hạt thảo quyết minh làm giảm bót trung gian
ADN gây hại đối với tế bào Hep G2 của người [34].
- Tác dụng chống oxy hoá: dịch chiết nước của thảo quyết minh ở mẫu
sống đã ức chế 94% sự oxy hoá của acid linoleic với liều 0,2mg/ml, ở mẫu sấy
170°c trong 5 phút và 200°c trong 5 phút đã lần lượt ngăn chặn 83% và 82%
sự oxy hoá của linoleic [35]. Ngoài ra, hạt thảo quyết minh còn có tác dụng
thu dọn gốc tự do, các thành phần có tác dụng gồm alatemin, cassiaside và
rubro 6-D-gentibioside. Trong đó, alaternin được chỉ ra là có tác dụng thu dọn
gốc tự do mạnh hơn các chất khác [28].
- Tác dụng chống gây đột biến invitro của anthraquinon dạng aglycol và
naphtho pyrone dạng glycosid từ hạt thảo quyết minh: cao chiết methanol từ
hạt thảo quyết mịnh chống lại aflatoxin BI (AFB1). Các chất có tác dụng:
chrysophanol, chryso-obtusin và aurantio-obtusin, cassiaside, rubrofusarin
gentiobiosid [29].
- Tác dụng hạ cholesterol: dùng lOg bột thảo quyết minh cho 2kg thể
trọng thỏ trong 1 ngày, liên tục trong 3 tháng có tác dụng hạ cholesterol máu,
tác dụng chống xơ cứng động mạch [37].
- Tác dụng hạ áp: nước chiết hạt thảo quyết minh có tác dụng hạ áp với
động vật thí nghiệm đã được gây mê [5, 32].
- Tác dụng chống ung thư: từ acid chrysophanic và một số dẫn chất

Huyền sâm 16g Thảo quyết minh sao Ì2g
Trắc bá sao lOg Kim anh lOg
Hoahoèsao lOg Ngưu tất lOg
Mạch môn lOg
Chủ trị: chữa cao huyết áp, nhức đầu, chóng mặt, ù tai, đau mắt đỏ, khó
ngủ, xuất huyết dưới da, trẻ em chảy máu mũi, hấp nóng, mồ hôi trộm, đau cơ,
rút gân, nhức nhối, đại tiện ra máu [10].
- Phương 2
Nhân hạt táo sao Sinh địa
Thảo quyết minh Mạch môn
Long nhãn Hạt sen
Mỗi thứ 12g
Chủ trị: chữa kinh hãi, hồi hộp, ít ngủ, khó ngủ hay nằm mê, hoảng hốt
mất trí [10].
- Phương 3
Hạt thảo quyết minh sao 20g Huyền sâm 12g
Dành dành 12g Ngưu tất 12g
Chủ trị: chữa đau mắt, mắt mờ, hoa mắt, đau lưng, co cơ.
- Phương 4
Hạt thảo quyết minh 9g Dã cúc hoa 9g
Mạn kinh tử 6g Mộc tặc 6g
Chủ trị: chữa viêm kết mạc cấp tính, mắt đỏ đau, chảy nước mắt nhiều,
sợ ánh sáng [26].
- Phương 5
Hạt thảo quyết minh lOg Vọng nguyệt sa lOg
Dạ minh sa lOg Cam thảo 6g
Hồng táo 5 quả
Chủ trị: chữa viêm võng mạc [26].
PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1- NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM

minh [13], chúng tôi chọn mẫu sấy tương đương với sao vàng (Ml: 150°C/20',
M2: 150°C/30\ M3: 160°c/10\ M4: 160°C/20') và sao cháy (M5: 220°C/2Ơ,
M6: 220°C/30') để nghiên cứu.
♦> Định tính anthranoid
- Sử dụng phản ứng Bomtraeger, phản ứng vi thăng hoa xác định sự có
mặt của anthranoid.
- Định tính các hợp chất anthranoid bằng SKLM: so sánh thành phần
anthranoid giữa mẫu sống với các mẫu sau khi chế biến. Qua đó sơ bộ đánh
giá sự biến đổi thành phần hoá học của thảo quyết minh sau khi chế biến.
♦> Định lượng anthranoid
Dựa trên phương pháp quang phổ tử ngoại [6].
Hàm lượng anthranoid toàn phần được tính theo rhein theo công thức:
X (%) = D x 0 ’64
m
Trong đó: D là mật độ quang, m (g) là khối lượng dược liệu khô tuyệt đối.
m = a(100 - độ ẩm)/100
2.7.2.2- Đánh giá môt số tác duns dươc lý của vỉ thuốc thảo auvết minh
trưỚ£ và sau khi chebien
♦> Nguyên tắc chọn mẫu thử
Dựa trên cơ sở phân tích định tính, định lượng, chọn mẫu sấy có hàm
lượng anthranoid tương đương với mẫu sao vàng, mẫu sao cháy, so sánh tác
dụng của các mẫu này với mẫu sống.
♦> Chế phẩm thử: MNC được chế dưới dạng cao lỏng 1:1.
*** Thử tác dụng nhuận tẩy
■ Tác dung trên ruốt thỏ cố lâp [221: Cô lập ruột thỏ theo phương pháp
Magnus. Ghi nhu động ruột thỏ cô lập trong dung dịch nuôi ruột ở 37,5°c trên
máy ghi một kênh Ugo-Basile. Theo dõi sự đáp ứng của ruột thỏ trong điều
kiện không có hoặc có chế phẩm thử.
■ Thử tác dung nhuân tẩy so với MgSO-1 [4]: Đánh giá khả năng giữ và kéo
nước vào lòng ruột của chế phẩm thử trên chuột dựa trên việc so sánh mức độ

nước (phản ứng 1).
Cho Iml dịch chiết A vào ống nghiệm, thêm lml dung dịch NaOH
10%, lắc nhẹ, quan sát màu sắc (phản ứng 2).
■ Đinh tính dang toàn phán:
- Chiết xuất: Lấy khoảng 0,5g bột MNC cho vào ống nghiệm, thêm
10ml H,S0410%. Đun cách thuỷ 10 phút. Tiến hành tiếp tục như chiết xuất để
định tính dạng tự do.
- Tiến hành phản ứng tạo màu tương tự như đối với dạng tự do.
Kết quả:
- Đối với dạng tự do, lúc đầu lớp amoniac có màu đỏ sim, lớp
chloroform có màu vàng, khi thêm dung dịch NaOH 10%, lớp nước chuyển
màu sẫm hơn, lớp chloroform mất màu. Các mẫu khác nhau có đậm độ màu
khác nhau.
- Đối với dạng toàn phần cũng cho kết quả tương tự như vậy.
Đậm độ màu sắc của các phản ứng được ghi ở bảng 2.1.
Bảng 2.1- Đậm độ màu của phản ứng định tính anthranoid
Mẫu
Dạng tự do
Dạng toàn phần
n h 3 NaOH (1)
NaOH (2) n h 3
NaOH (1)
NaOH (2)
Sống ++
+++ +++ ++
+++ +++
Sao vàng
++ +++ +++ ++
+++ +++
150°C/20’ ++

và khuấy đều để bay hết hơi nước. Sau đó đặt lên trên cốc nrrô{TijffĩỔíìpm kính
và đặt lên trên lam kính một miếng bông tẩm nước lạnh. Đốt mạnh trong 5
phút, lấy ra soi dưới kính hiển vi vật kính 10X
Kết quả cho thấy: tất cả các MNC đều cho những tinh thể hình kim màu
vàng chứng tỏ thành phần anthranoid vẫn tồn tại trong các mẫu
♦♦♦ Định tính bằng SKLM
- Chiết xuất: Lấy lg bột MNC cho vào bình nón, thêm 30ml nước và
lml HClđạc (định tính dạng tự do không thêm HClđậc), đun cách thuỷ trong 15
phút, để nguội, lọc lấy dịch lọc, thêm 25ml ether ethylic, lắc đều. Gạn bỏ lớp
nước, lấy lớp ether, lọc qua Na,S04khan vào cốc có mỏ (lOOml) rồi đem bốc
hơi cách thuỷ đến cắn. Hoà tan cắn trong lml ether ethylic được dịch chấm
sắc ký.
- Triển khai sắc ký: Chấm khoảng 10 |il dịch chiết lên bản mỏng
Silicagen đã hoạt hoá ờ 105°c/lh. Triển khai với hệ dung môi Toluen -
Ethylacetat - Acid formic (5:4: 1).
Để khô bản mỏng ở nhiệt độ thường, hiện màu bằng hơi NH3 và quan
Kết quả phân tích anthranoid dạng tự do, dạng toàn phần bằng SKLM
của MNC được ghi ở bảng 2.2, 2.3 và hình 2.1, 2.2, 2.3, 2.4.
Nhận xét:
- Đối với anthranoid dạng tự do, các mẫu Ml, M2, M3, M4 cho 4 vết có
màu sắc và Rf tương đương với các mẫu sống, sao vàng. Các mẫu M5, M6 cho
5 vết có màu sắc và Rf tương đương với mẫu sao cháy, trong đó có 3 vết tương
đương với mẫu sống.
- Đối với anthranoid dạng toàn phần, các mẫu Ml, M2, M3, M4 cho 5
vết có màu sắc và Rf tương đương với các mẫu sống, sao vàng. Các mẫu M5,
M6 cho 6 vết có màu sắc và Rf tương đương với mẫu sao cháy, trong đó có 4
vết tương đương với mẫu sống.
Bảng 2.2- Kết quả SKLM anthranoỉd dạng tự do (RplOO)
\M ẫu
VeK

57 57
59
4 56 56 56
57 57 57 54
54
56
5
51 51 52
6
41 41 42
Hình 2.1- SKĐ dạng tự do các mẫu Hình 2.2- SKĐ dạng tự do các mẫu
sống, sao vàng, Ml, M2, M3, M4 sống, sao cháy, M5, M6
Bảng 2.3- Kết quả SKLM anthranoid dạng toàn phần (RplOO)
\M ẫu
V et\
Sống
Sao
vàng
150°c
/20'
(Ml)
150°c
/30'
(M2)
160°c
/10'
(M3)
160°c
/20'
(M4)

6 45 45
45 45
45 46 44
44 44
7
30
30 31
Hình 23- SKĐ dạng toàn phần các Hình 2.4- SKĐ dạng toàn phần các
mẫu sống, sao vàng, Ml, M2, M3, M4 mẫu sống, sao cháy, M5, M6
W
i
ì *'■ * t
m T
.
: t
■
1
s SVM1M2M3M4
s sc M5M6
2.2.1.2- Đinh lương Anthranoid toàn phán
*1* Xác định độ ẩm của dược liệu
Các mẫu dược liệu trước khi định lượng được xác định độ ẩm trên máy
xác định độ ẩm tự động Precisa HA60.
♦> Định lượng
- Chiết xuất: Cân chính xác khoảng a (g) bột MNC (đã được nghiền và
rây qua rây có đường kính mắt rây là 0,18mm) cho vào bình nón 250ml, thêm
30ml nước cất, đun hồi lưu cách thuỷ trong 15 phút. Để nguội, thêm 0,lg
NaHC03, lắc đều trong 2 phút, lọc qua giấy lọc. Lấy 10ml dịch lọc cho vào
bình cầu 100ml, thêm 20ml dung dịch FeCl3 5%. Đun hồi lưu cách thuỷ trong
20 phút, thêm 2ml acid HC1 đặc rồi tiếp tục đun hồi lưu cách thuỷ trong 20