i
LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Nha Trang em đã được các
Thầy Cô cung cấp, truyền đạt và chỉ bảo nhiệt tình tất cả kiến thức nền tảng và
chuyên môn quý giá. Ngoài ra em còn được rèn luyện một tinh thần học tập và làm
việc rất cao. Đây là những yếu tố cơ bản giúp em nhanh chóng hoà nhập với môi
trường làm việc sau khi ra trường. Đó cũng là nền tảng vững chắc giúp em thành
công trong sự nghiệp sau này.
Đồ án tốt nghiệp là cơ hội để em có thể áp dụng, tổng kết những kiến thức mà
mình đã học, đồng thời rút ra những kinh nghiệm thực tế quý giá trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Trước hết cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu trường ĐH
Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm, phòng thí nghiệm Công nghệ
thực phẩm, phòng thí nghiệm Hóa sinh, phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Thu Hương - GVHD trực
tiếp của em đã giúp em hoàn thành đồ án một cách thuận lợi. Cô đã luôn bên cạnh
để đóng góp sửa chữa những thiếu sót, khuyết điểm em mắc phải và đề ra hướng
giải quyết tốt nhất từ khi em nhận đề tài đến khi hoàn thành.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các Thầy Cô. Em cũng
xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đã ủng hộ, động viên tinh thần
giúp em hoàn thành đồ án tốt nghiệp.
Nha Trang, tháng 06 năm 2012
Sinh viên Tăng Thị Thủy
2.3.2. Nội dung nghiên cứu 27

iii
2.3.3. Bố trí thí nghiệm 27
2.3.4. Phương pháp xử lý nguyên liệu và nuôi cấy tế bào nấm men 30
2.3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 31
2.3.5.1. Phương pháp phân tích 31
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu suất lên men rượu32
3.1.1.Ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến thời gian lên men 32
3.1.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men 34
3.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men rượu 35
3.2.1. Kết quả thí nghiệm xác định số lần tái sử dụng hạt gel 36
3.2.2. Kết quả xác định nồng độ oxy hòa tan bổ sung 37
3.3. Đề xuất quy trình lên men từ rỉ đường bằng tế bào cố định 39
3.4. Đánh giá hiệu suất lên men 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41
Kết luận 41
Đề xuất ý kiến 41 iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ lên men rượu etylic . 8
Hình 1.2. Nấm men vừa mới chớm nở được quan sát bằng kính hiển vi điện tử 11
Hình 1.3. Hình ảnh tế bào cố định trong alginate. 12
Hình 1.4. Cấu tạo của hai monomer α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid 16
Hình 1.5. Các dạng alginate 17
Hình 1.6. Mô hình tạo gel dạng vỉ trứng của alginate canxi. 18
Hình 1.7. Quá trình tạo gel alginate canxi theo phương pháp khuếch tán 22

2
H
5
OH hay CH
3
-CH
2
-OH. Rượu etylic là
một chất lỏng, không màu, mùi thơm dễ chịu, vị cay, nhẹ hơn nước, sôi ở nhiệt độ
78,39
0
C, hóa rắn ở -114,15
0
C, tan trong nước vô hạn.
Nguyên liệu để sản xuất rượu etylic là các nguyên liệu giàu tinh bột (gạo,
sắn, ngô…) hay đường (rỉ đường…).
Tác nhân để thực hiện quá trình lên men rượu etylic thường là nấm men.
Người ta có thể cho trực tiếp hoặc nhốt chúng trong các „bẫy‟ và khi đó nó trở thành
tế bào cố định. Tế bào cố định được hiểu là ngăn không cho chúng chuyển động tự
do với các tế bào lân cận nó trong pha lỏng. Có nhiều phương pháp cố định đã được
các nhà khoa học nghiên cứu, ở đây chỉ xét phương pháp “bẫy” gel.
Cố định tế bào là một hướng phát triển mới trong công nghệ sinh học.
Những tế bào cố định được nghiên cứu và ứng dụng vào trong hóa học, thực phẩm,
nhiên liệu, y học và xử lý nước thải…
Hiện nay, nguồn rỉ đường chủ yếu dùng làm thức ăn gia súc. Vấn đề xử lý rỉ
đường đang là vấn đề được các nhà máy đường quan tâm, trong đó có một hướng là
cho lên men rượu. Kỹ thuật lên men rượu bằng phương pháp cố định tế bào đã được
áp dụng, nhưng việc nghiên cứu về kích thước hạt gel, phương pháp hoạt hóa tế bào
chưa được quan tâm. Do đó, em được sự phân công của Nhà trường và Khoa Công
nghệ thực phẩm cho thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hƣởng của kích thƣớc hạt

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rỉ đường mía
Thành phần
Trung bình
Biến động
Nước
20
17-25
Sucroza
35
30-40
Glucoza
7
4-9
Fructoza
9
5-12
Các chất khử khác
3
1-5
Các glucid khác
4
2-5
Khoáng
12
7-15
Các chất chứa N
4,5
2-6
Các acid không chứa N
5

Thành phần
Rỉ đƣờng cải đƣờng
Rỉ đƣờng mía
Sucroza
66
44
Fructoza
1
13
Glucoza
1
10
Acid amin
8
3
Các chất khác
24
30

4
Dùng rỉ đường làm nguyên liệu để lên men vì trong rỉ đường có những đặc
tính phù hợp với quá trình lên men như sau:
Rỉ đường chứa hàm lượng đường cao. Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều
chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng. Trong
đó có vitamin H (biotin) là chất kích thích sinh trưởng đối với phần lớn nấm men.
Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàm lượng biotin cao hơn rỉ đường từ
củ cải đường. Chính vì thế, ở nhiều nước không có mía, người ta phải nhập rỉ đường
từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để đảm bảo hàm lượng biotin cho
nấm men phát triển. Tuy nhiên rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp
với quá trình lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men, ta phải tiến hành

Theo công thức trên lượng CO
2
thu được chiếm (44:46)% = 95,65% khối
lượng cồn tinh khiết, qua khảo sát tại cơ sở sản xuất cồn với giá hiện tại 1.800

5
đồng/kg CO
2
sản phẩm phụ thu được đủ trả chi phí nhân công lao động trong toàn
cơ sở.
 Bảo quản rỉ đường
Hiện nay các công ty sản xuất đường thải ra một lượng rỉ đường từ 32%÷35%
so với đường thành phẩm. Với lượng lớn rỉ đường như vậy không thể tiêu thụ, sử
dụng hết ngay trong vụ ép vì vậy phải có kho chứa.
Kho chứa rỉ đường thường là hệ bồn hình tròn có thể đổ bê tông cốt thép
hoặc bằng thép có sức chứa từ 100 - 200 tấn rỉ, mỗi bồn nhất thiết phải có mái che
mưa nắng. Trước van xả bố trí hệ thống gia nhiệt để làm loãng trước khi lấy rỉ đường
vì rỉ đường để lâu bùn cát và một số đường saccharose kết tinh chặt dưới đáy, mùa
lạnh sẽ không thể lấy ra được
1.2. Tổng quan về quá trình lên men rƣợu etylic
1.2.1. Bản chất của quá trình lên men rƣợu etylic [15]
Lý thuyết về lên men rượu đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu từ lâu.
Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy, khi lên men
đường không chỉ biến thành rượu mà còn tạo ra acid axetic. Năm 1810, Gaylussac
nghiên cứu và thấy rằng, cứ 45 phần khối lượng đường glucoza khi lên men sẽ tạo
ra 23 phần alcol etylic và 22 phần khí cacbonic. Trên cơ sở đó ông đưa ra phương
trình tổng quát về lên rượu như sau:
C
6
H

tham gia chuyển hóa đường thành rượu và CO
2
.
Dịch men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1 gam men ướt có độ ẩm khoảng
70†75% chứa tới 14 tỉ tế bào. Bề mặt của mỗi tế bào chiếm 5.10
-5
mm
2
. Như vậy 1
gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7.000 cm
2
. Nhờ có bề mặt lớn này nên
nấm men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất nhanh. Cơ chế lên men rượu
xảy ra như sau:
Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu
vào bên trong. Ở đó các emzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối
cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic. Hai chất này đều khuếch tán và
tan vào môi trường xung quanh. Rượu rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch
lên men, còn khí cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm. Lúc đầu hòa tan hoàn
toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào men và lớn dần tới mức lực
đẩy Archimedes lớn hơn khối lượng tế bào men cộng bọt khí, lúc đó tế bào cùng bọt
khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và hợp thành tiếng rào rào. Bọt
khí tan, tế bào men lại chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thụ và lên men rồi
lại sản xuất ra rượu và khí cacbonic. Như vậy tế bào nấm men từ chỗ là vi sinh vật
không chuyển động đã biến thành tế bào luôn chuyển động trong quá trình lên men.
Nhờ đó mà tăng nhanh tốc độ hấp thụ và chuyển hóa đường thành rượu. Khi đường
và các chất dinh dưỡng trong canh trường còn ít, một lượng lớn tế bào men sẽ lắng
xuống đáy thùng, dịch lên men sẽ trong dần.
Nấm mem có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25†30%, nhưng chậm.
Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15†18%. Nồng

chất dinh dưỡng khác lên bề mặt của nó. Sau đó các chất khuếch tán qua màng bán
thấm của tế bào vào trong tế bào. Sự khuếch tán này tuân theo định luật chung của
sự thẩm thấu. Nước có thể ra vào tự do nhưng đường và các chất hòa tan khác ra
vào tế bào rồi thì không quay ra được. Trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men,
đường được chuyển hóa thành rượu etylic và CO
2
. Rượu etylic và CO
2
được tạo
thành thoát ra khỏi tế bào và khuếch tán vào môi trường, rượu etylic hòa tan vào
trong nước. Lúc này môi trường lên men nhanh chóng được bão hòa bởi khí CO
2
,
khí CO
2
hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men tạo thành như một cái phao, thắng
được trọng lực của tế bào cả bọt khí và nấm men nổi lên. Bọt khí vỡ, tế bào nấm
men lại chìm xuống. Như vậy nếu quan sát vào môi trường lên men ta thấy nấm

8
men vốn không di động trở thành di động. Hiện tượng này góp phần tăng nhanh quá
trình trao đổi chất và tốc độ lên men được tăng nhanh một cách tương ứng [4].

C
6
H
12
O
6
Glucose

-CHO Acetaldehyde

Glycerin Hình 1.1: Sơ đồ lên men rượu etylic [4].
o Các thời kì lên men rượu etylic
Xét về mặt hóa học, lên men rượu etylic bình thường chia làm hai thời kỳ:
- Thời kỳ cảm ứng: Là thời kỳ hướng phản ứng xảy ra theo chiều hướng (a).
Lúc này sản phẩm hình thành glycerin. Bởi lẽ lúc này hàm lượng acetaldehyde
(CH
3
CHO) chưa có nhiều để nhận hydro của coldehydrogensae mà hydro lại
chuyển đến cho phosphoglyceraldehyde tạo thành phosphoglyceryl bị thủy phân
giải phóng acid phosphoric và glycerin.
Thời kỳ tĩnh: Là thời kỳ hướng phản ứng xảy ra theo chiều hướng (b). Lúc
này lượng acetaldehyde đã hình thành nhiều, nên hydro từ alcoldehydrogenase lại
CH
3
-CH
2
OH Ethanol

CH
2
OH
CHOH

CH
2

Bx cho
thêm các chất vi lượng như (NH
4
)
2
SO
4
, B
1
…rồi chuyển vào thùng lên men, trong
thùng lên men đã có sẵn tế bào cố định, sau 64 giờ bình thường đạt:
Độ rượu từ 7% - 11% V.
Axit từ 3 -5 g/lít.
Nồng độ dịch lên men 4 – 4,5
0
Bx.
Đường sót 12 – 15 g/lít.
Lên men gián đoạn nồng độ rượu không cao mà chi phí sản xuất cao, vì vậy
nhiều công ty đường áp dụng phương pháp lên men bán liên tục.
+ Phương pháp lên men bán liên tục (lên men chuyển tiếp): tức là nồng độ
Bx trong dịch lên men không được thay đổi lớn (cao quá 12
0
Bx và thấp dưới 9
0
Bx).
Do đó khi đến thời điểm lên men phát triển tốt (thường nồng độ từ 10
0
Bx – 11
0
Bx )

Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia. Nấm men sinh sôi
nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein
chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào, nên nhiều loại nấm men còn được sử
dụng để sản xuất protein. Ngoài ra nấm men còn được sử dụng trong công nghệ sản
xuất bánh mì. Tuy nhiên, cũng có nhiều loại nấm men có hại, gây bệnh cho người
và gia súc, làm hư hỏng lương thực, thực phẩm.
Nấm men dùng trong sản xuất rượu etylic thường là các chủng thuộc giống
Saccharomyces, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường
nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin,
peptid), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào. Sau đó, hàng loạt các
phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất
này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và lên men của nấm men
được tiến hành.
Đặc tính hình thái: có 2 loại nấm men là nấm men chìm và nấm men nổi
Nấm men chìm: Khi quan sát bằng kính hiển vi các tế bào nấm men khi nảy
chồi thường đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi. Hình dạng chủ yếu là hình cầu.

11
Nấm men nổi: Tế bào nấm men mẹ và con sau nảy chồi thường dính lại với
nhau tạo thành như chuỗi các tế bào nấm men còn hình dạng chủ yếu hình cầu hoặc
ovan với kích thước 7 – 10
m
.
Cấu tạo
- Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota
và thuộc giới nấm.
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích
thước nhỏ, từ 5-14 mircomet, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử.

Hình 1.2. Nấm men vừa mới chớm nở được quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Hình 1.3. Hình ảnh tế bào cố định trong alginate.
1.3.2. Ƣu điểm của việc cố định tế bào
Trong những năm cuối thế kỷ 20, khi mà kỹ thuật cố định enzyme và tế bào ra
đời nó đã được quan tâm, chú ý đặt biệt để thay thế một phần cho các quá trình lên
men truyền thống. Các chất dinh dưỡng hay cơ chất khi đi qua tế bào cố định này sẽ
tạo ra các sản phẩm mong muốn. Có hai đặc điểm có giá trị kinh tế trong việc cố
định tế bào.
Một là: Hoạt tính xúc tác sinh học tương đối kéo dài và mạnh. Sau khi cố định
sự giảm hoạt tính là không thể tránh khỏi được vì các protein là thành phần của chất
xúc tác sinh học không ổn định hoàn toàn. Việc xác định thời gian cho đến khi mất

13
hoạt tính hoàn toàn là không thuận lợi do đường cong suy giảm hoạt tính là không
tuyến tính. Tương tự như quá trình phân ra phóng xạ, người ta thường xác định thời
gian bán rã của chế phẩm cố định. Thời gian này có thể kéo dài từ vài giờ đến vài
năm.
Hai là: Tính bền của chế phẩm tạo thành. Nếu bình phản ứng cao với chất bên
trong đứng yên, các phần bên dưới sẽ bị ép bởi trọng lượng chất bên trên và ảnh
hưởng đến tốc độ dòng chảy và hiệu suất phản ứng. Với các bình phản ứng có cánh
khuấy hay thổi khí, các phần tử sẽ chuyển động và bị vách bình làm mài mòn. Khi
đó tế bào sẽ bị tách ra khỏi chất mang và chất mang bị phá hủy. Cả hai việc đó làm
bẩn dòng sản phẩm. Các bọt khí tạo ra do tế bào cố định cũng ảnh hưởng đến quá
trình, nó ngăn cản không cho cơ chất tiếp xúc với chất xúc tác.
Một khía cạnh khác của tính bền là sự ngăn cản quá trình phân hủy do vi sinh
vật. Điều này có thể thực hiện dưới điều kiện mà vi sinh vật tạp không thể phát triển
như: nhiệt độ cao, nồng độ cơ chất cao, dung dịch có tính kiềm hay acid cao. Trong
một số trường hợp đặc biệt, tính chất kháng sinh của chất mang như lòng trắng
trứng có thể xem như một ưu điểm đặc biệt. Có thể dùng biện pháp thanh trùng ban
đầu cơ chất. Khi đã có hoạt tính và độ bền cao thì vấn đề cần phải quan tâm là sự
khuếch tán ra của sản phẩm phản ứng.

+ Chất mang có điện tích

Rẻ, đơn giản, nhẹ nhàng,
có khả năng tái sử dụng.

Thất thoát tế bào, nhạy
cảm đối với sự thay đổi
pH.
Kết bông
Nhẹ nhàng, đơn giản
Thất thoát tế bào, khuếch
tán giới hạn.
Bẫy
+ polyme tự nhiên
+ polyme nhân tạo

Nhẹ nhàng, đơn giản

Khuếch tán giới hạn, độc,
đắt tiền.
Liên kết đồng hóa trị
Vĩnh cửu
Khuếch tán giới hạn, độc,
đắt tiền.
Ngăn chặn
Nhẹ nhàng, đơn giản, có
khả năng tái sử dụng.
Khuếch tán giới hạn, độc,
đắt tiền.



16
1.3.5. Giới thiệu chung về chất mang Alginate [13]
Alginate là muối của acid alginic, một thành phần cấu tạo của vách tế bào rong
nâu. Acid alginic là một co-polyme mạch thẳng được cấu thành từ hai monomer là
α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid. Hai monomer này liên kết với nhau để
tạo thành acid alginic thông qua liên kết 1-4 glucoside.
Tỉ lệ hai loại acid này phụ thuộc vào vị trí địa lý, mùa vụ, giống loài và vị trí
trên thân rong dùng để tách chiết acid alginic. Sự khác biệt về thành phần này ảnh
hưởng đến các tính chất của alginate, đặc biệt là tính chất tạo gel. Hai monomer này
kết hợp với nhau để tạo ba block:
- Block homopolyguluronic: gồm các gốc aicd guluronic nối tiếp nhau,
GGGG
- Block homopolymanuronic: gồm các gốc manuronic nối tiếp nhau,
MMMM
- Block luân hợp (alternating): hai gốc luân phiên nối tiếp nhau,
MGMGMG

Hình 1.4. Cấu tạo của hai monomer α-L-guluronic acid và β-D-manuronic acid
Khối lượng phân tử của alginate thương mại nằm trong khoảng 32000 - 200000
tương ứng với múc độ polymer hóa từ 180 ÷ 930. Alginate là một keo ưa nước do
đó nó dễ hút ẩm từ không khí. Hàm lượng ẩm cân bằng của alginate phụ thuộc vào
độ ẩm tương đối của không khí. Acid alginic và các muối của nó sẽ giảm chất lượng
ở nhiệt độ trên 32
o
C, do đó chúng cần được bảo quản ở nơi thoáng mát

17

Hình 1.5. Các dạng alginate

++
. Gel tạo thành chứa chủ yếu là nước 99 - 99,5% và 0,5
- 1% là alginate. Đã có nhiều công trình nghiên cứu để làm rõ tính chất của các liên
kết ngang và xác định cấu trúc của hạt gel.
Trước kia người ta cho rằng việc tạo gel đơn giản chỉ là liên kết ion giữa hai
nhóm carboxyl của hai chuỗi polymer gần nhau thông qua ion tạo gel như Ca
++
.
Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy sự liên kết phức tạp hơn, cả với các
nhóm hydroxyl. Hiện nay mô hình tạo gel được chấp nhận rộng rãi nhất là mô hình
vỉ trứng. Hình 1.6. Mô hình tạo gel dạng vỉ trứng của alginate canxi.
Do cấu trúc đặc biệt của phân đoạn poly guluronic, nó tạo thành dạng gấp
nếp như vỉ trứng. Khoảng không gian tạo thành giữa các vỉ khi xếp chồng lên nhau
tương tự như chỗ đặt quả trứng, điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống
này khá phù hợp với kích thước của ion Ca
++
.

19
Việc tạo gel chủ yếu thực hiện ở các phân đoạn poly guluronic. Do đó những
alginate có tỷ lệ poly guluronic cao sẽ tạo gel tốt hơn, hạt gel cứng chắc hơn.

Pseudomonas dennitrificans
Zymononas mobilis

Isomaltulose
Nước uống có cồn
Ethanol
Tảo xanh - lục (blue - green algane)
Anbena sp

Ammonia
Nấm (Fungi)
Kluyveromycesblugaricus
Saccharomyces cervisiae
Saccharomyces bajnus

Thủy phân dịch sữa
Ethanol
Champagne
Tảo (Algae)
Botryococcus braunii

Hydrocarbons
Tế bào thực vật (Plant cells)
Chatharanthus roseus
Daucus carota
Các loài thực vật khác

Alkaloids
Alkaloids
Các hạt giống nhân tạo