1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN
PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN GVHD: Ts. PHAN NGỌC HÒA

TP. HỒ CHÍ MINH, ngày 11/12/2011
2

MỤC LỤC
1.

Ưu điểm và hạn chế 11
5. PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT THUỐC NHUỘM (DYE-BINDING) 12
5.1. Nguyên tắc chung 12
5.2. Phương pháp Bradford 12
5.2.1. Nguyên tắc 12
5.3. Phương pháp Udy 13
5.3.1. Nguyên tắc 13
5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm 13
6. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ TNBS (TNBS-
SPECTROPHOTOMETRIC) 13

6.1. Nguyên tắc 13
6.2. Ưu điểm và hạn chế 13
7. PHƯƠNG PHÁP HẤP THU TIA CỰC TÍM (ULTRAVIOLET
ABSORPTION) 14

7.1. Nguyên tắc chung 14
7.2. Ưu điểm và hạn chế 14
7.3. Lĩnh vực áp dụng 14
8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY) 15
8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography) 15
8.1.1. Nguyên tắc 15
8.1.2. Các bước tiến hành tổng quát 16
8.1.3. Ưu điểm và hạn chế 16
8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography) 17
8.2.1. Nguyên tắc 17
4

8.3.
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High-Performance Liquid

nhanh nhất có thể và đặt ngay vào môi trường cách ly ở nhiệt độ thấp (từ 0 đến
4
o
C). Điều này là tối quan trọng, đặc biệt khi protein được cách li để tiến hành các
phân tích sâu hơn (ví dụ như điện di), môi trường cách ly bao gồm những chất
ngăn ngừa sự tạp nhiễm của vi khuẩn (VD:
0,1 mM sodium azide), bảo vệ protein
khỏi những chất tạo phức (VD: Cu, …) như (VD: Ethylenediaminetetraacetic acid
2 mM), ngăn chặn các thoái hóa protein do các protease nội sinh (VD:
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0,1 mM).
Protein cần được phân riêng và tinh chế, nhằm múc đích tách riêng biệt protein, ở
dạng đồng nhất hoặc một nhóm protein phù hợp cho quá trình phân tích sâu hơn,
từ nguyên liệu ban đầu. Có nhiều biện pháp phân riêng và tinh chế protein, cụ thể
như:
o Chiết (Etraction)
o Deproteination
o Lọc (Filtration)
o Ly tâm (Centrifugation)
o Kết tủa bằng muối (Salting-Out)
o Thẩm tách và thẩm tách điện (Dialysis & Electrodialysis)
o Lọc bằng phương pháp sắc ký
6 2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
2.1. Tổng quan
2.1.1. Lĩnh vực áp dụng
Phương pháp Kjeldahl là một kỹ thuật quan trọng trong phân tích thực phẩm, nó
được sử dụng như một tham chiếu để so sánh với các phương pháp khác.
2.1.2. Ưu điểm và hạn chế

O, bẻ
gãy và chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ thành khí NH
3
tự do, sau đó liên
kết với NH
3
tạo thành muối (NH
4
)
2
SO
4
.
7

b) Muối (K
2
SO
4
, Na
2
SO
4
): cần thiết cho quá trình nâng cao nhiệt độ trong
quá trình vô cơ hóa.
c) Các chất xúc tác đẩy nhanh quá trình oxy hóa: bao gồm các kim loại: Hg,
Cu, Se; oxide: CuO, HgO, P
2
O
5

C, do đó muối K
2
SO
4
hoặc
Na
2
SO
4
được thêm vào nhằm tăng điểm sôi của hỗn hợp, giảm thời gian phân
hủy các hợp chất hữu cơ, tạo điều kiện phân hủy những hợp chất khó vô cơ
hóa. Nhiệt độ sôi của hỗn hợp tăng gần như tuyến tính với tỷ lệ K
2
SO
4
/H
2
SO
4

(g/mL), đạt 383
o
C vơi tỷ lệ 1:1, ở tỷ lệ 2:1 nhiệt độ đạt 450
o
C. K
2
SO
4
không
chỉ được thêm vào để tăng nhiệt độ sôi hỗn hợp mà còn hấp thu bớt lượng

là 16% , hàm lượng khá cao và ổn định).
Nitơ
protein
= Nitơ
tổng
– Nitơ
phi protein

Hệ số cho các nhóm thực phẩm nhất định. Cụ thể như:

2.3. Định lượng nitơ tổng
 Nguyên tắc tiến hành:
2.3.1. Vô cơ hóa mẫu (trong tủ Hotte)
 Ở nhiệt độ cao, dưới tác dụng của H
2
SO
4
các hợp chất chứa nitơ bị phân hủy và bị
oxy hóa thành CO
2,
H
2
O, và NH
3
. NH
3
kết hợp H
2
SO
4

2
SO
4
đã xác định chính xác nồng độ. NH
3
sẽ kết hợp H
2
SO
4
tạo thành
(NH
4
)
2
SO
4
.
 NH
3
+ H
2
SO
4 dư
 (NH
4
)
2
SO
4
+ H

2
10 – 15%, CuSO
4
10% trong hỗn hợp với NaOH 10% với tỉ lệ
1:1.
 Lọc kết tủa protein.
 Vô cơ hóa dung dịch phi protein.
 Cất đạm.
 Chuẩn độ.
 Tính toán kết quả.
3. PHƯƠNG PHÁP BIURET
3.1. Nguyên tắc chung
 Phương pháp Biuret dựa trên sự hình thành phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại
ở bước sống 540nm của đồng và liên kết amide trong dung dịch kiềm mạnh. Cường
độ màu tỷ lệ thuận với số liên kết peptide trong chuỗi.

Hình 1.phức hợp protein-đồng

Hình 2. đo cường độ màu sắc ở 540 nm
10 3.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: đơn giản, nhanh chóng
Hạn chế:
o Độ nhạy kém
o Dễ bị nhiễu khi mẫu protein chứa các thiol, DNA, saccharide hoặc chất
béo.
 Phản ứng Biuret trải qua một số CẢI BIẾN sau.
3.3. Định lượng protein bằng phương pháp so màu, có mặt thiol

Ellman (1962), đề xuất phương án đo độ hấ
p thu của phức hợp protein – đồng ở
263nm, sử dụng đồng sulfate 0,04% và dung dịch NaOH 2N. sự lựa chọn bước
11

sóng trong trường hợp mẫu protein có chứa DNA bị giới hạn, do khả năng hấp
thu cao của DNA. Và do đó, Itzhaki và Gill (1964) phát triển thủ tục dựa trên đo
độ hấp thu ở 310 nm, nó an toàn khi sử dụng với mẫu ngay cả khi nồng độ DNA
đạt 0,7 mg/mL trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng.
4. PHƯƠNG PHÁP LOWRY
4.1. Nguyên tắc chung
Phương pháp được phát triển bởi Lowry (1951) dựa trên cơ sở phản ứng màu
của thuố
c thử Folin-Ciocalteau với liên kết peptide trong protein, peptide và các acid
amin thơm (tyrosine, tryptophan,histidine) trong môi trường kiềm thích hợp.
Phản ứng tiến hành qua hai giai đoạn cơ bản:
a) Phản ứng Biuret: ion đồng (Cu
2+
) sẽ tạo phức với protein có ít nhất hai liên
kết peptide.
b) Khử phosphomolybdic acid (thuốc thử Folin): khử Folin bởi phực hợp
protein đồng thành molybdenum blue có độ hấp thu cực đại ở 750 nm.

Hình 3. đo cường độ màu ở 750 nm
Thuốc thử Folin-Ciocalteau có phản ứng với một số chất hóa học khác như
amino acid tự do, các hợp chất thiol, saccharide, lipid, fatty acid, các amin,
EDTA,… . đây là nguyên nhân gây nhiễu cho quá trình định lượng bằng phương
pháp Lowry. Để loại bỏ hoặc hạn chế tác động của những chất gây nhiễu trên, kỹ
thuật phải trải qua các quá trình bổ sung bao gồm: nâng nhiệt trước và sau khi cho
thuốc thử Folin, thêm perhydrate, chloramine-T, SDS, trích với dung môi hữu cơ

5.2. Phương pháp Bradford
5.2.1. Nguyên tắc
Được phát tri
ển bởi Bradford (1976), thuốc nhuộm được sử dụng là Coomassie
Brilliant Blue G-250 tạo phức với protein trong môi trường kiềm yếu. Có thể tạo kết
tủa ở nhiệt độ thấp (0
o
C) hoặc sử dụng TCA ở nhiệt độ phòng, hay dùng muối calci
phosphate để đông tụ protein.
13 Hình 4. phản ứng nhuôm màu với Coomassie Brilliant Blue G-250

5.3. Phương pháp Udy
5.3.1. Nguyên tắc
Được phát triển bởi Udy (1971), thuốc nhuộm được dùng là Acid Orange 12 để
kết tủa phức protein – thuốc nhuộm.
5.4. Ưu điểm và hạn chế của phương pháp liên kết thuốc nhuộm
Ưu điểm: phương pháp này nhanh và đơn giản, thuận tiện cho việc sử dụng
thường xuyên, rất nhạy (nhạy lơn Lowry 2 – 3 lần), ít tốn kém. Màu thường phát
triển chưa đến 5 phút và bền trong 0,5 – 1 h. Ít bị nhiễu bởi các muối, chất đệm
và chất khử như đối với phương pháp Lowry. Không cần phải thao tác khéo léo
cũng như sử dụng các hóa chất ăn mòn như phương pháp Kjeldahl.
Hạn chế: do mỗi loại thuốc nhuộm có ái lực khác nhau đối với một số protein
tinh khiết sẽ phản ứng và liên kết khác nhau, tùy thuộc vào cấu trúc của chúng.
Hầu như phương pháp phải được điều chỉnh với từng loại protein cho mỗi lần áp
dụng. Do đó phương pháp không được áp dụng để định lượng protein tổng trong
các kiểm nghiệm tổng quát.
6. PHƯƠNG PHÁP QUANG PH

Ưu điểm của phương pháp này là ít bị nhiễu do acid nucleotic.

7.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm:
nhanh và đơn giản.
Hạn chế :
Kết quả không chính xác với dung dịch có hơn 20% acid nucleotic hoặc dung
dịch bị đục.
7.3. Lĩnh vực áp dụng
Phương pháp này đặt biệt được khuyến nghị áp dụng để phân tích một loạt
các mẫu có hàm lượng protein tương đối thấp hoặc nồng độ muối amoni cao khiến
các phương pháp khác trở nên không hiệu quả. Thông qua định lượng protein, phương
pháp được dùng để kiểm tra mức
độ thủy phân protein.
15 8. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ (CHROMATOGRAPHY)
Phương pháp sắc ký thường dùng để tinh sạch protein, sau đó protein được
tinh sạch được phân tích định lượng thông qua các phương pháp khác vi dụ
như đo qua phổ.
8.1. Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Column Chromatography)

Hình 5. cột sắc ký lọc gel
Phương pháp sắc ký điện di được sử dụng thành công để phân tách trực tiếp
protein khỏi các thành phần khác trong dịch chiết thực phẩm. Nó được sử
dụng như một kỹ thuật giúp tiện lợi hơn cho việc phân đoạn sơ bộ các peptide
trước khi chúng được phân tích sâu hơn bằng cách lập bản đồ TLC (sắc ký
bản mỏng) peptide, sắc ký cột trao đổi ion, điện di mao quản và các phươ
ng

đủ để tinh sạch được một loại phân tử protein mong muố
n nào đó dù quá trình
sắc ký được lặp đi lặp lại nhiều lần, thay vào đó người ta thường phải áp dụng
một chuỗi các bước kỹ thuật để có thể thu được một phân đoạn chứa một lượng
lớn loại protein cần quan tâm nghiên cứu.
8.1.3. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: phương pháp sắc kỹ lọc gel tương đối đơn giản, khi cột gel được
kết hợp dòng chảy qua quang phổ kế và hệ thống máy vi tính theo dõi quá
trình, phương pháp này sẽ thuận tiện và hữu ích.
Hạn chế: đối với phương pháp lọc gel, thời gian lưu của các acid amin,
protein có chứa vòng thơm trong cột sẽ kéo dài, mà không bị phân tách theo
thứ tự trọng lượng phân tử.
17 8.2. Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography)

Hình 6. sắc ký trao đổi ion
8.2.1. Nguyên tắc
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một
điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một
điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là
phương pháp sắc ký trao đổi ion.
Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn m
ột điện tích nhất
định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái
18

dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose
(CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác

amino mang điện tích của các chất được tách ra.
8.3.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: hiệu năng cao so với phương pháp sắc ký khí thể hiện rõ khi phân
tích các hợp chất hữu cơ. Các acid amin, peptide, protein chỉ cần hòa tan
trong dung môi thích hợp như dansyl chloride, 2,4-dinitrophenol,
fluorescamine, o-phthalaldehyde. Phân tích tiến hành ở nhiệt độ phòng,
không cần phân hủy hoặc chuyển hóa thành các dẫn xuất dễ bay hơi. Đối với
RFC, cho kết quả tách biệt hoàn toàn các chất , dung môi sử dụng ít độc hại.
Hiệu quả tách và tính chọn lọc rất cao.
Hạn chế: đối với phương pháp RFC, khó dự đoán thời gian lưu đối với các
hợp chất chưa xác định rõ ràng, nói chung thời gian lưu tăng theo kích thước
và độ kỵ nước của phân tử. Tuy nhiên đối với các peptide, protein óc kích
thước lớn hơn, số lượng và vị trí của các bản kị nước trên bề mặt phân tử trở
nên chiếm ưu thế.
8.4. Phương pháp sắc ký ái lự
c – hấp phụ (Affinity Chromatography)
Tách và tính chế các loại protein đặc thù thường tiêu tốn thời gian và không
hiệu quả. Phương pháp sắc ký ái lức không vấp phải những hạn chế đó. Nó là
quá trình rất cụ thể cho sự hấp phụ chọn lọc sinh học và sau đó phục hồi hợp
chất từ các phối tử cố định.
8.4.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa họ
c
chuyên biệt. trong thực hành, cột được điền đầy nhựa sắc ký ái lực, sau đó phủ
lớp protein lên, các thành phần có ái lực với nhựa sẽ bị giữ lại, trong khi các
thành phần đi kèm vượt qua cột mà không bị cản trở. Thành phần bị giữ lại do
tạo phức hợp sẽ được tách rửa bằng cách điều chỉnh độ pH hoặc thêm dung dịch
muối, cột này có thể
tái sử dụng.
8.4.2. Ưu điểm và hạn chế

2
. Dòng cuối cùng chỉ
có khí N
2 vào
hệ thống GC, được phát hiện đầu dò TCD

Hình 8. veggies cap

Hình 9. quy trình của Phương Pháp Dumas
9.2. Ưu điểm và hạn chế
Ưu điểm: khả năng lặp lại kết quả tốt, nhanh chóng
hạn chế: thiết bị đắc tiền Tài liệu tham khảo

1) Methods of Analysis of Food Components and Additives, edited
by Semih Ötles, Ege University, Department of Food
Engineering, Izmir, Turkey.

2) Food Chemistry & Analysis, Professor David B. Min ,Food
Science & Technology 60. 3) Food Analysis Laboratory Manual, Second Edition, edited by S.
Suzanne Nielsen ,Purdue University ,West Lafayette, IN, USA.

4) Kỹ Thuật sinh hóa, Phạm Thị Ánh Hồng, NXB Đại Học Quốc Gia
TP.HCM.