TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ THỊ NHANH
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
SINH TỔNG HỢP PROTEASE TỪ Aspergillus niger
BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN RẮN
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

hƣớng dẫn của Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn
là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài
“Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease từ Aspergillus niger
bằng phƣơng pháp lên men rắn” đã đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Ngƣời hƣớng dẫn Ngƣời viết Trần Thanh Trúc Lê Thị Nhanh

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -ii-
LỜI CẢM ƠN

Em cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi đƣợc thực hiện luận văn tốt nghiệp
dƣới sự hƣớng dẫn của Trần Thanh Trúc.
Lời cảm ơn đầu tiên, em xin đƣợc gởi đến Cô Trần Thanh Trúc đã giành nhiều thời
gian và công sức để tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em
hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời, Thầy luôn đóng góp
cho em rất nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian hƣớng dẫn, cùng em
tìm hƣớng giải quyết cho những vấn đề mới phát sinh để có kết quả thu nhận tốt
nhất.
Trong suốt quá trình làm luận văn, em cũng đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt
tình cũng nhƣ sự ủng hộ, động viên to lớn của Chị Lê Thị Bảo Ngọc và các anh chị
trong phòng thí nghiệm D006, các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm K36.
Xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm
– khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tận tình
giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt quá

HPO
4
(0,4%), NaCl (0,1%), MgSO
4
(0,05%), thời gian ủ thích hợp là 72
giờ ở nhiệt độ 31

C. Ước tính hoạt tính protease đạt được ở điều kiện lên men tốt
nhất là 0,126

0,012 U/g cơ chất.
Từ khóa: Aspergillus niger, bột đậu nành, hoạt tính cao, lên men rắn SSF,
protease acid.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -iv-
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
TÓM TẮT iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH HÌNH vi
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2
Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE 3

3.2.3 Phƣơng pháp thu thập và xử lý kết quả 22
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23
3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23
3.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình len men sinh
tổng hợp protease trên môi trƣờng rắn SSF 23
3.3.3 Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu
nhận protease có hoạt tính cao từ Aspergillus niger 24
3.3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ban đầu đến quá trình
sinh tổng hợp protease 25
3.3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp
protease ở các nhiệt độ khác nhau 26
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA CƠ CHẤT LÊN MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP
PROTEASE 27
4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ ẨM MÔI TRƢỜNG LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG
TỔNG HỢP PROTEASE HOẠT TÍNH CAO 28
4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA pH MÔI TRƢỜNG LÊN MEN BAN ĐẦU ĐẾN KHẢ
NĂNG THU NHẬN PROTESE TỪ Aspergillus niger 29
4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ ĐẾN QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP PROTEASE
Ở CÁC NHIỆT ĐỘ KHÁC NHAU 31
4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính protease theo thời gian ủ tƣơng ứng từng nhiệt độ 31
4.4.2 Xác định nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men sinh tổng hợp
protease từ A. niger ở thời gian tối ƣu (72 giờ) 32
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
5.1 KẾT LUẬN 34
5.2 ĐỀ NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ix
PHỤ LỤC 2. SỐ LIỆU THỐNG KÊ xiii
PHỤ LỤC 3. MỘT SỐ HÌNH ẢNH xxii

Bảng PL1.1: Cách pha dung dịch đệm citrate – phosphate ix
Bảng PL1.2: Xây dựng đƣờng chuẩn nồng độ tyrosine xi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ

Ngành Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng -viii-
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

A. niger Aspergillus niger
CFU Colony Forming Unit (mật số bào tử hình thành)
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
EGTA Ethylene Glycol Tetra Acetic acid
KCN Khu Công Nghiệp
PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
rpm revolutions per minute
SSF Solid State Fermentation
TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn
TTHĐ Trung Tâm Hoạt Động
U Đơn vị hoạt tính enzyme
U/g Units per weight (gram) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 g cơ chất)
U/mL Units per volume (mL) of substrate (hoạt tính enzyme trong 1 mL cơ chất)
v/w volume/weight (tỷ lệ thể tích/khối lƣợng)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 1 -
CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI
Protease là một trong những enzyme đƣợc ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn và
đƣợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y tế, nghiên cứu
khoa học … Trong công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to
Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 2 -
Các ngành công nghiệp nói chung và công nghiệp thực phẩm nói riêng đang trên đà
phát triển. Điều này hứa hẹn cho một nhu cầu to lớn về protease. Mặt khác, các phụ
phế phẩm dồi dào của nƣớc ta có thể sử dụng nhƣ nguồn cơ chất cho quá trình sản
xuất protease ƣa acid từ A. niger. Sử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất
lƣợng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật ở Việt Nam vẫn đang đƣợc nghiên cứu
trong nhiều năm qua. Tuy nhiên, những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực này vẫn
chƣa đáp ứng đƣợc việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng của nhóm enzyme
này trong đời sống.
Việc nghiên cứu cải thiện và nâng cao hoạt tính protease đƣợc thu nhận từ vi sinh
vật, thăm dò các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho quá trình tổng hợp enzyme này là
vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. Chính vì vậy, nghiên cứu về khả
năng sinh tổng hợp protease cần đƣợc tiến hành một cách cụ thể thông qua các bƣớc
khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình sinh tổng hợp protease từ dòng nấm mốc
trên.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài này là tìm ra điều kiện lên men thích hợp cho
quá trình sinh tổng hợp protease ƣa acid trên môi trƣờng rắn (SSF) với dòng A.niger
đặc hiệu.
Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài đƣa ra các nội dung nghiên cứu sau:
1) Khảo sát ảnh hƣởng của cơ chất đến quá trình lên men rắn sinh tổng hợp
protease.
2) Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm môi trƣờng đến khả năng thu nhận protease có
hoạt tính cao từ Aspergillus niger.
3) Khảo sát ảnh hƣởng của pH ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp protease.
4) Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian ủ đến quá trình tổng hợp protease ở các nhiệt
độ khác nhau.

Nguồn:
Protease
Exopeptidase
Endopeptidase
Metallo protease
Serine protase
Aspartic protease
e
Carboxypeptidas
eCarboxypeptida
se
Aminopeptidase
Cystein proteases
e
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 4 -
 Exopeptidase: tách liên kết peptide ở gần cuối của chuỗi polypeptide. Dựa theo vị
trí hoạt động của các enzyme này, exopeptidase đƣợc phân loại tƣơng ứng thành
aminpeptidase và carboxypeptidase.
• Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
• Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide đầu C tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
 Endopeptidase: cắt các liên kết peptide ở vùng bên trong của chuỗi polypeptide.
Tùy theo động học cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành 4 nhóm: serine
protease, protease aspartic, protease cystein và metalloprotease.
• Serine protease: là những protease chứa nhóm OH của gốc serin trong trung tâm
hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.

ion đồng cũng ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme này (Rao et al., 1998).
Protease ƣa acid thƣờng đƣợc tiết ra bởi nấm (Tremacoldi et al., 2004). Một số
protease ƣa acid tiết ra từ các dòng Aspergillus gọi aspergillopepsin (Percin et al.,
2009) và có hoạt động tối đa ở pH 3 - 4 (Rao et al., 1998)
2.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của protease
Trong trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin
đặc trƣng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên
cứu chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét
chung nhƣ sau (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004):
 TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và một số trƣờng hợp còn
có cả cofacto kim loại. Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21A,
có thể phân biệt thành sáu phần dƣới TTHĐ (subsite), mỗi phần dƣới TTHĐ tƣơng
ứng với gốc aa trong phân tử cơ chất. Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên
cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Rhizopus chinenis và
Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa
chúng có khe hở vào khoảng 20A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc
Asp

35 và Asp

215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.
 Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo
hơn vì cấu trúc không gian của chúng không đƣợc giữ vững bởi các cầu disulphite.
2.1.4 Cơ chế phản ứng của enzyme protease
Những enzyme peptidase đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân
thông qua hai bƣớc chính (Barrett, 1994):
 Bƣớc 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị với nguyên tử cacbon trong
nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.
Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium
(phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân

Michealis – Menten cũng đƣợc ứng dụng để thể hiện tốc độ của phản ứng và đặc
trƣng cho protease. Ở giai đoạn đầu phản ứng, nếu nồng độ enzyme đƣợc giữ cố
định và nồng độ cơ chất thay đổi, ngƣời ta nhận thấy vận tốc phản ứng tăng khi
nồng độ cơ chất tăng. Khi nồng độ cơ chất tiếp tục tăng, đƣờng biễu diễn uốn cong
và với nồng độ cơ chất cao thì vận tốc không còn gia tăng nữa và đƣờng biễu diễn
tiệm cận với giá trị V
max
.

Hình 2.4: Phƣơng trình Michealis – Menten
K
m
là hằng số Michealis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc ½ vận tốc V
max
.
PE
k
ES
k
SE 
21


k

2.1.5.4 Ảnh hưởng của cation kim loại đến hoạt động của protease
Các cation kim loại thƣờng đƣợc sử dụng với vai trò chất hoạt hóa đối với hoạt
động của enzyme (Marangoni, 2003). Hoạt động của protease gia tăng cùng với sự
tăng nồng độ cation kim loại và đạt đến giá trị tối ƣu, ở trên điểm này hiệu quả hoạt
động của enzyme thƣờng giảm. Ở nồng độ cao, cation kim loại ức chế hoạt động
của enzym. Điều này đƣợc hiểu dựa trên nhóm carboxyl bị khóa bởi cation kim loại,
phản ứng enzyme không xảy ra và đây là nguyên nhân ức chế khi có nồng độ
cation kim loại cao (Nari et al., 1991). Theo Leiting và Wicker (1997) ở cùng mức
độ ion hóa, các cation hóa trị II kích hoạt protease khác nhau. Đối với protease đƣợc
ly trích từ việc lên men chủng Acinetobacter sp. NQ6, K
+
, Na
+
, Mg
2+
là những ion
hoạt hóa mạnh, có khả năng làm tăng hoạt tính protease, còn ion Ca
2+
có ảnh hƣởng
không đáng kể. Ion Zn
2+
chỉ ức chế protease ở nồng độ cao 10-20 mM. Các ion kim
loại khác Cu
2+
, Co
2+
, Pb
2+
và Hg
2+

Pepstatin A
Acid protease
1 g/mL
Leupeptin
Thiol protease
1 g/mL
EDTA & EGTA
Protease kim loại
0,1  1 mM
Nguồn: Phan Thị Bích Trâm (2011)
2.1.6 Tầm quan trọng của việc sử dụng protease trong thực tiễn
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thuộc công nghiệp thực phẩm,
công nghiệp nhẹ, dƣợc phẩm, nông nghiệp, nghiên cứu khoa học… Yêu cầu trên
toàn thế giới về enzyme này gia tăng ngày càng nhanh chóng (Vishwanatha et al.,
2009).
Trong công nghiệp chế biến thịt, protease đƣợc dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy
phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.
Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt), tiêm dung dịch enzyme vào
thịt (tiêm dung dịch enzyme vào con vật trƣớc khi giết mổ) (Nguyễn Thị Tuyết Mai,
2006).
Trong chế biến thủy sản, enzyme protease đƣợc sử dụng nhằm rút ngắn thời gian
làm và cải thiện hƣơng vị của nƣớc mắm (Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2006).
Trong công nghiệp sữa, protease đƣợc dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính
làm đông tụ sữa của chúng. Và ứng dụng này đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành
công nghiệp sữa trong quá trình sản xuất pho mát (Neelakantan et al., 1999).
Protease từ một số vi sinh vật nhƣ : A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,…
đƣợc dùng trong sản xuất phomat (Trần Xuân Ngạch, 2007). Trong sản xuất bánh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ
Tuy nhiên, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nghiên cứu ở thập niên 70 của
thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu phân chia nhóm của Whittaker (1969, trích dẫn
bởi Sumbali, 2005), đến giới (Alexopolous và Mims, 1979; trích dẫn bởi Sumbali,
2005) đã đề nghị khóa phân loại mới cho giới nấm nói chung và A. niger nói riêng
thuộc:
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 10 -
Ngành: Amastigomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
Lớp: Ascomycetes
Lớp phụ: Plectomycetidae
Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger
Nguồn: Sumbali, (2005)
Với đặc điểm chính trong họ Eurotiaceae là bào tử đính ở dạng thể bình (Cao Ngọc
Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trƣởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dƣỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thƣớc nhỏ, màu
trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trƣờng nuôi cấy
để hút dƣỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.
- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thƣớc lớn hơn
khuẩn ty dinh dƣỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hƣớng vào không khí
để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dƣỡng tạo thành các
hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình

với cơ chất đó nhằm chuyển cơ chất từ dạng phức tạp khó hấp thu thành dạng cơ
chất đơn giản dễ hấp thu (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Nói cách khác, muốn thu
nhận enzyme nào thì phải có sự hiện diện của cơ chất đặc hiệu với enzyme đó trong
môi trƣờng nuôi cấy (Rombouts và Pilnik, 1981). Tác động của cơ chất đặc hiệu đạt
hiệu quả cao khi ở một nồng độ nhất định. Nếu vƣợt quá nồng độ tối đa cho phép
thì khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm (Rombouts và Pilnik, 1981).
Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh tổng hợp
protease cũng nhƣ các enzyme khác từ vi sinh vật. Trong thành phần môi trƣờng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 12 -
phải có đủ các chất đảm bảo đƣợc sự sinh trƣởng bình thƣờng của vi sinh vật và
tổng hợp enzyme (Lê Gia Hy và Khuất Hữu Thành, 2010; bảng 1.2).
Bảng 2.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào
nấm mốc Aspergillus sp.
Nguyên tố
Nguồn gốc
Chức năng
Thức ăn đa lƣợng
Carbon
Hợp chất hữu cơ hoặc
CO
2

Xây dựng thành phần vật chất cơ bản
của tế bào
Oxygen
H
2

Xây dựng nên các hợp chất hữu cơ.
Tham gia các quá trình sinh năng lƣợng
nhƣ các proton
Phospho
Phosphate vô cơ
Xây dựng nên các acic nucleic,
nucleotide, phospholipid, acid teichoic
Thức ăn vi lƣợng
Lƣu huỳnh
SO
4
2-
,
H
2
S, SO
2
, hợp
chất hữu cơ chứa lƣu
huỳnh
Xây dựng nên cystein, methionine,
glutathione và nhiều coenzyme
Kali
Muối kali
Xây dựng nên các cation vô cơ của tế
bào và là đồng nhân tố của các enzyme
Magie
Muối magie
Dạng các cation vô cơ của tế bào và là
đồng nhân tố cho nhiều phản ứng

lƣợng enzyme lớn nhất. Sự thiếu hụt cấu tử này không đƣợc bù đắp bằng sự dƣ thừa
của cấu tử kia (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Ngoài ra, do acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme, acid amin có ảnh
hƣởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng nhƣ quá trình sinh tổng hợp enzyme.
Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng
lƣợng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004)
2.3.1.2 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Các nguyên tố đa vi lƣợng có ảnh hƣởng lớn đến sự sinh trƣởng và tổng hợp
enzyme của vi sinh vật. Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh
chất và nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy
hóa sinh học. Phospho ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi và các vi
sinh vật khác. Cation Mg
2+
có ảnh hƣởng đến độ bền nhiệt của enzyme tuy nhiên
MgSO
4
sẽ có ảnh hƣởng xấu đến sự tổng hợp enzyme bởi nấm sợi. Trong khi đó,
lƣu huỳnh - có mặt trong các acid amin quan trọng nhƣ methionine, cysteine, có vai
trò tích cực trong việc kích thích sự hình thành enzyme. Ngoài ra, calcium, mangan,
corban,… cũng ảnh hƣởng đến sự tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
Nhìn chung, thành phần khoáng đƣợc sử dụng trong nuối cấy protease khá ổn định,
chủ yếu thành phần là: yeast extract (0,5%), K
2
HPO
4
(0,4%), NaCl (0,1%), MgSO
4

(0,05%) (Irfan et al., 2011).
Mặc dù thành phần cơ chất lên men có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm mốc,

enzyme (Pandey et al., 2000). Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng
tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60% để
tránh sự nhiễm khuẩn, vi sinh vật lạ (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004).
2.3.4 Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng
Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt, do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và
hàm ẩm thấp nên giá trị pH của dịch trích sau lên men thƣờng ít thay đổi trong suốt
thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên, giá trị pH ban đầu của môi trƣờng ủ có ảnh hƣởng
không nhỏ đến sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme. Giá trị pH tối ƣu
của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch,
2007). Mặc dù vậy, tùy thuộc vào đặc điểm từng enzyme, loại cơ chất và nguồn
nấm mốc, giá trị pH tối ƣu cho hoạt động của vi sinh vật lên men, tạo ra enzyme là
khác nhau. Thêm vào đó, trong quá trình sinh tổng hợp enzyme, pH thƣờng giảm
nhẹ vào thời gian đầu do sự phân hủy các chất, điển hình nhƣ sự chuyển hóa các
protein thành các acid amin mang tính acid, sau đó pH thƣờng tăng dần do quá trình
trao đổi chất tạo ra các chất mang tính kiềm nhƣ ammonium,… Tuy nhiên, quá trình
này còn phụ thuộc vào nguồn vi sinh vật và sản phẩm tạo thành (Lê Gia Hy và
Khuất Hữu Thành, 2010).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và SHƯD - 15 -
Theo O'Donnell et al., (2001) Aspergillus niger có khả năng giảm pH xuống sau hai
ngày lên men.
2.3.5 Ảnh hƣởng của thời gian ủ
Thời gian lên men ảnh hƣởng đáng kể đến việc sinh tổng hợp enzyme cũng nhƣ
hoạt tính của enzyme. Vi sinh vật cần thời gian để phát triển và sản sinh enzyme.
Tuy nhiên, khi thời gian ủ quá dài, môi trƣờng cạn dần chất dinh dƣỡng, vi sinh vật
phát triển kém và do đó hoạt tính enzyme sẽ giảm. Khảo sát thực nghiệm là phƣơng
pháp phổ biến để xác định đƣợc thời gian nuôi thích hợp giúp thu đƣợc enzyme có
hoạt tính cao và hiệu suất thu hồi lớn (Radha, 2012). Việc tạo bào tử là hiện tƣợng